骨形態(tài)生成蛋白在臨床骨重建中的應用進展

蔡志杰 凌雅紅 劉同明

骨形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一種由二聚物分子組成的疏水性酸性糖蛋白[1]。1965年，Urist[2]將脫鈣牛骨植入肌肉及皮下，成功誘導異位成骨，由此認為骨基質中存在一種可以誘導骨形成的物質，并將之稱為BMP。提取的天然BMP是由幾種不同分子量蛋白組成的混合物，一個成熟的BMP分子是依賴半胱氨酸二硫鍵固定的雙鏈(每鏈含有400個氨基酸)多肽二聚體分子,其重要結構中40%～50%與轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β高度同源。目前已確認的BMP家族成員達40多個[3]。經研究發(fā)現(xiàn)，BMP參與人體的物質代謝及不同組織器官的形成和發(fā)育，參與胚層和肢體的形成，與心血管、呼吸、胃腸、泌尿、生殖及神經系統(tǒng)的發(fā)育密切相關，并在發(fā)育期及成年后等各個時期都發(fā)揮不同作用[4-5]。在骨重建中，BMP是骨骼發(fā)育和維持成人骨穩(wěn)態(tài)所必需的蛋白，且在骨折愈合過程中發(fā)揮重要作用[6]。在BMP家族亞型中，BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8和BMP-9都有促進成骨的作用，臨床上BMP-2，BMP-4和BMP-7應用較多[7-12]。下文對BMP-2，BMP-4和BMP-7在臨床骨重建中的應用加以綜述。

一、BMP的信號傳導途徑

有研究結果表明，BMP的信號傳導過程主要是通過BMP與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合完成的，這些受體又分為Ⅰ型和Ⅱ型，其結構相似，都包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內區(qū)[13-15]。胞外區(qū)富含糖基化半胱氨酸，負責配體的識別和結合，在細胞外形成絲蘇氨酸四聚體復合物，激活受體磷酸化后經過跨膜區(qū)進入細胞內。胞內區(qū)是富含絲氨酸/蘇氨酸激酶的高度同源結構域，可激活下游信號。細胞內傳導途徑主要有2種:一種是Smad依賴性途徑，即BMP配體、BMP受體和Smad分子介導的途徑；另一種是非Smad依賴途徑，即絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)p38途徑[15-16]。(1)Smad依賴性途徑：Smad依賴性傳導途徑是通過Smad分子介導。Smad分子有2個高度保守結構域，即氨基末端的Mad同源1(MH1)和梭基末端的Mad同源2(MH2)，兩者之間由不同序列氨基酸連接。其中所有Smad分子具有MH2結構域，而MH1存在于Smad1/5/8(受體激活的Smad，R-Smad) 和 Smad4(通用Smad，Co-Smad)中。MH1結構域具有DNA連接功能；MH2結構域具有效應分子的功能。在R-Smad梭基末端還有特征性SSXS序列，是BMPⅠ型受體磷酸化位點[16-17]。BMP與細胞膜表面Ⅰ、Ⅱ型受體結合形成復合物，Ⅱ型受體自身磷酸化被激活，Ⅰ型受體被磷酸化Ⅱ型受體激活。磷酸化Ⅰ型受體與R-Smads結合，導致R-Smads羧基末端SSXS序列磷酸化，有活性的R-Smads形成，兩分子磷酸化的R-Smads同聚化并與一分子Co-Smads結合從而形成三聚體復合物，復合物進入細胞核，轉錄Runx2等相關基因的表達，從而調節(jié)成骨細胞相關基因的表達，以達到骨再生和骨重建的目的[18-19]。(2)非Smad依賴途徑：在非Smad依賴途徑中，BPM不僅能與細胞膜上的BMP-Ⅰ受體結合，還能繼續(xù)與游離的BMP-Ⅱ受體進行特異性結合，再通過受體結合蛋白使TGF-β激活激酶(TGF-β activated kinase，TAK)連接蛋白(TAK binding protein，TAB)被激活，激活的TAB可在X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP)的作用下形成TAB-TAK復合物，而TAK下游的MAPK細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、p38、JNK被激活發(fā)生經典的三級酶促級聯(lián)反應，從而使MAPK激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)被磷酸化激活，進而磷酸化激活MAPK激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MAPKK)，最后發(fā)生絲氨酸和酪氨酸兩個位點的磷酸化，從而激活MAPK[20-22]，進入細胞核調控細胞核內的Runx2等相關基因的轉錄與翻譯[23]，調節(jié)成骨細胞的相關基因表達，以達到骨再生和骨重建(bone remodeling)的結局。

二、骨重建

骨重建是由破骨細胞去除老的或損壞的骨骼(骨吸收)，隨后由成骨細胞形成新骨(骨形成)的一個持續(xù)的終身性過程。在骨重建中，骨吸收和骨形成之間保持著動態(tài)平衡[24]。成骨細胞和破骨細胞在骨重建中起關鍵作用，這兩種細胞的協(xié)同作用承擔著整個生命體的骨重建任務。成骨細胞是骨形成細胞，來源于骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，可分泌大量礦化基質并增殖分化形成骨細胞，骨細胞包埋進礦化基質形成骨；破骨細胞是一種多核細胞，起源于造血系統(tǒng)單核細胞，起到骨骼溶解作用[25-26]。破骨細胞可能通過表達和合成BMP來促進骨形成，從而促進成骨細胞在骨吸收部位的聚集、增殖和分化[27]。另外，BMP主要誘導未分化的間充質細胞分化為軟骨和新生骨,其誘導成骨作用可分為趨化期、分化期、骨質形成期和重塑期[28]。Shimizu等[29]的研究結果表明，BMP是骨形成激動劑，誘導成骨作用顯著，且受到其他細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血小板衍生因子(platelet derived gowth factor，PDGF)等的協(xié)同或抑制，而TNF-α作為骨吸收激動劑和骨形成抑制劑，是由成骨細胞產生并以自分泌方式抑制自身功能的。

三、BMP在臨床骨重建中的應用

1.BMP-2在臨床骨重建中的應用：2002年重組人BMP(recombined human bone morphogenetic protein,rhBMP)-2和rhBMP-7被美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準應用于治療骨不連、脛骨開放性骨折以及牙槽骨缺損等，并被廣泛應用于臨床[30]。Richards和Anderson[31]在對rhBMP-2在四肢骨折治療應用的探索中發(fā)現(xiàn)其最佳應用劑量為4.2～8.4 mg。Rearick等[32]對48例經足踝部融合或骨折骨不連高風險患者進行了回顧性分析，用rhBMP-2作為骨愈合的增強劑，得出結論為rhBMP-2是一種安全有效的足踝高危手術骨愈合輔助劑。鎮(zhèn)萬源等[33]對106例因腰椎退變接受融合手術的患者進行了回顧性研究，發(fā)現(xiàn)腰椎間盤融合術中融合器植入BMP-2骨修復材料療效顯著,不僅能夠提供即刻的生物學穩(wěn)定性,達到有效的結構性支撐作用,而且還能促進患者椎間隙前后緣高度的恢復，明顯改善患者術后疼痛癥狀。陳啟剛等[34]在對15例SandersⅢ、Ⅳ型跟骨骨折患者進行的回顧性隨訪中發(fā)現(xiàn)鎖定接骨板結合rhBMP骨修復材料治療跟骨骨折可有效維持跟骨解剖形態(tài),促進骨愈合,減少了骨折不愈合的發(fā)生率。王軍等[35]對59例創(chuàng)傷性骨髓炎患者進行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)利用硫酸鈣+萬古霉素+BMP-2一期復合植入模式治療創(chuàng)傷性骨髓炎成骨可靠且安全性高，并發(fā)癥發(fā)生率低，抗感染效果滿意。盧巖巖等[36]采用髓芯減壓自體髂骨打壓植骨聯(lián)合BMP-2治療38例(52髖)早中期缺血性股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)患者，可延緩或穩(wěn)定疾病，阻止股骨頭塌陷，推遲甚至避免關節(jié)置換術，取得了令人比較滿意的療效。程文俊等[37]采用改良髓芯減壓技術結合組織工程化自體骨、異體骨、BMP-2復合物治療國際骨循環(huán)研究會(Association Research Circulation Osseous，ARCO)分期Ⅱ期、ⅢA期股骨頭壞死患者，中期結果是可有效改善患髖功能，在一定程度上可以延緩股骨頭壞死進程。胡磊等[38]對2012年6月至2015年7月收治的64例A型脊柱胸腰段骨折患者進行回顧性病例對照研究，發(fā)現(xiàn)與單純后路傷椎椎弓根釘內固定椎體內植骨比較,采取后路傷椎椎弓根釘內固定椎體內植骨聯(lián)合rhBMP-2治療A型胸腰椎骨折可恢復椎體穩(wěn)定性,縮短骨折愈合時間,降低并發(fā)癥發(fā)生率。

周思睿等[39]在動物實驗中利用載有rhBMP-2和聚乳酸緩釋微球的復合生物支架修復一定范圍內的犬橈骨臨界骨缺損(長骨干缺損達到長骨干直徑的1.5倍)，發(fā)現(xiàn)這一方法能有效減少自體骨移植量，為進一步研究臨界及超臨界骨缺損的治療與修復提供了實驗依據。苗瑩珂[40]構建的載有BMP-2的聚乳酸-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)微球與納米纖維復合支架作為一種有蛋白緩釋載體的復合支架材料能夠應用于骨修復,在大鼠體內能夠誘導成骨細胞分化為成熟骨細胞,進而形成礦化基質,具有異位成骨和原位骨缺損修復的能力，從而為臨床應用提供更多的選擇。有研究者利用固相多肽合成法合成含有17個氨基酸的新型短肽P17-BMP-2，不僅在體外具有促進大鼠MSC增殖的活性并誘導MSC分化成骨，而且負載于膠原基納米羥基磷灰石/左旋聚乳酸(nano-hydroxyapatite/poly-L-lacticacid，nHAC/PLLA)中，有較好的緩釋效果[41]。Wang等[42]在大鼠實驗測試中發(fā)現(xiàn)BMP-2比BMP-4能更有效驅動多能干細胞向軟骨細胞分化，并在體內持續(xù)影響軟骨祖細胞，使軟骨祖細胞走向更成熟的表型。朱樂全等[43]在大白兔實驗研究中發(fā)現(xiàn)BMP-2基因轉染的MSC與纖維蛋白膠的混合物可以促進前交叉韌帶重建后的腱-骨愈合。Tan等[44]在大鼠穿刺型椎間盤退變(IDD)模型中發(fā)現(xiàn)，rhBMP-2通過白細胞介素(interleukin,IL)-6、TNF-α和IL-10來顯著降低髓核組織和細胞的炎性反應，從而抑制髓核細胞凋亡，降低基質蛋白，減輕椎間盤退變，從而為椎間盤退變的治療提供了新的思路。常曉朋等[45]從細胞及基因水平揭示BMP-2和TGF-β2具有協(xié)同促進MSC成骨分化的機制，為骨細胞的再生提供了實驗和理論基礎。周慧芳[46]用第3代慢病毒載體將BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7和BMP-9導入小鼠MSC(MC3T3-E1)，使其有效表達，促進MC3T3-E1向成骨細胞分化，另外BMP-2和BMP-7雙基因聯(lián)合轉染能有效提高成骨轉化，這為組織工程學骨重建研究提供了重要的理論依據和技術支持。盧小娟[47]通過利用新西蘭兔進行實驗研究發(fā)現(xiàn)，BMP-9對骨缺損的成骨修復作用強于BMP-2，為后期BMP家族的臨床應用提供了更開闊的思路。

2．BMP-4在臨床骨重建中的應用：石少輝等[48]通過采用免疫組化方法測量發(fā)現(xiàn)， ONFH患者硬化帶形成與BMP-4表達強弱呈正相關，BMP-4的高表達可能促進硬化帶的形成，因此可在臨床上應用以延緩關節(jié)置換時間。Wu等[49]發(fā)現(xiàn)同源盒基因MEIS2在維持牙髓MSCs成骨分化潛能方面起著重要作用，而MSCs是一種可靠的有應用前景的牙、骨等組織再生細胞來源，受到BMP-4刺激后MEIS2表達明顯上調，從而促進MSCs成骨分化，達到骨組織再生的目的。李玨丹等[50]用免疫磁珠法分離培養(yǎng)人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，觀察細胞生長情況，鑒定細胞的表型(CDl46、CD44和CD34)和多項分化潛能(成骨、成脂)，發(fā)現(xiàn)BMP-4、BMP-7和BMP-4+BMP-7均可促進PDLSCs增殖和成骨分化，BMP4+BMP7聯(lián)合作用時細胞增殖和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性更強，具有協(xié)同作用，為BMP在口腔醫(yī)學臨床應用提供了依據。

Umebayashi等[51]在利用大鼠進行的實驗中將含有BMP-4的AcGFP質粒載體與2%牛集膠原和β-磷酸三鈣顆?；旌?，制成基因激活基質(gene activation matrixs，GAMs),將GAMs凍干移植到顱骨上,第8周在含1 mg BMP-4的標本中檢測到骨形成，從而驗證了BMP-4的成骨作用。楊明[52]在動物實驗中用缺陷型單純皰疹病毒載體系統(tǒng)建立組織工程骨，在體外使骨髓MSCs安全高效穩(wěn)定表達血管內皮生長因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF165)及BMP-4基因，具有顯著的體外成骨作用，在體內可以促進成骨和血管化作用，對缺損兔橈骨具有良好的骨傳導性及骨誘導性，與自體骨移植效果相近。姜明宇等[53]在大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)將BMP-4基因轉入骨髓MSCs后，可以治療先天性脊柱裂畸形。Huang等[54]利用畢赤酵母的密碼子相對同義密碼子使用值，對人BMP-4 (human BMP-4，hBMP-4) 成熟結構域的DNA序列進行了優(yōu)化，在搖瓶培養(yǎng)的畢赤酵母中，優(yōu)化序列(48 mg/L)hBMP4蛋白表達水平比原序列(12 mg/L) hBMP-4提高了4倍，通過檢測細胞增殖和誘導小鼠異位軟骨形成，優(yōu)化后的DNA序列能顯著提高畢赤酵母中hBMP-4蛋白的表達，并能產生更具有生物學活性的重組hBMP-4，在異源蛋白表達系統(tǒng)中生產出更多的可用于臨床的具有生物活性的BMP-4，從而為BMP4的高效合成提供了方法。曹一汀[55]通過PCR(qRT-PCR)研究發(fā)現(xiàn)，升高的BMP-2和BMP-4主要來源于軟骨下骨，這一結果提示堿性成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)通過調控軟骨下骨活性上調其BMP表達水平，進而促進關節(jié)軟骨的損傷修復，由此構建的定向釋放FGF2的膠原基復合材料可能成為一種有應用前景的促進關節(jié)軟骨修復的新型生物材料，并在家兔關節(jié)軟骨修復中得以證實。陳臨新等[56]構建了表達BMP-4的腺病毒載體系統(tǒng),并成功轉染脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，在體外通過ELISA法檢測BMP-4基因修飾ADSCs軟骨相關蛋白的表達情況，通過動物實驗證實體內BMP-4基因修飾的ADSCs復合藻酸鈣凝膠支架可修復小型豬膝關節(jié)軟骨缺損，為臨床軟骨損傷的修復提供了一種選擇。

3.BMP-7在臨床骨重建中的應用：重組BMP于2001年8月在英國上市，Giannoudis和Tzioupis[57]對BMP-7在持續(xù)性骨折不愈合、假體周圍骨折治療和骨切除、髖臼重建后骨折愈合，牽張成骨、游離腓骨移植和關節(jié)融合術等各種臨床條件下的適應證類型和療效進行了評價，653例患者成功率為82%(535例)，未見局部或全身不良反應，因此認為BMP-7作為一種骨刺激劑是安全可靠的，可以被作為外科醫(yī)生對骨折進行手術治療的一種強有力的輔助手段。Friedlaender等[58]通過122例BMP-7治療脛骨骨不連的大規(guī)模多中心臨床試驗發(fā)現(xiàn)，采用BMP-7治療脛骨骨不連與自體骨移植相比具有無供區(qū)疼痛、出血少和手術時間大大縮短等優(yōu)勢，安全有效。Dimitriou等[59]使用rhBMP-7治療連續(xù)25例骨折不愈合患者，利用臨床和放射學相結合的評估方法，平均隨訪時間為4.2個月，未見并發(fā)癥或不良反應，認為rhBMP-7作為骨刺激劑是安全的，并且建議在手術中應考慮使用rhBMP-7來治療骨折不愈合。Papanna等[60]在應用BMP-7局部植入治療四肢耐藥骨折不愈合的安全性和有效性研究中，通過采用源自牛骨的膠原蛋白糊劑中局部植入BMP-7治療52例患者，進行平均時間為5.6個月的臨床和放射學隨訪，認為將BMP-7植入牛源性膠原糊劑中對四肢抵抗性骨折不愈合的治療可起到有效輔助作用。Singh等[61]在2004至2011年對連續(xù)接受BMP-7治療的患者進行前瞻性隨訪，對骨折愈合情況進行定期放射學和臨床評估，直至患者骨折愈合，認為應用BMP-7可以成功治療頑固性上肢骨折不愈合。Zimmermann等[62]對BMP-7與同種異體移植物對脛骨骨折延遲愈合患者的治療效果進行了評估，對26例接受同種異體移植物患者使用BMP-7單一劑量3.5 mg粉末與2 ml患者血液、1 mg膠原的混合物，用止血海綿將其固定在在植入區(qū)域，其中24例患者骨折愈合，認為BMP-7有較高的缺陷修復能力。還有學者采用復乳溶劑揮發(fā)法(W1/O/W2)分別制備負載BMP-2和BMP-7的2種聚乙丙交酯-聚乙二醇(polyglycolide-polyethylene glycol，PGLA-PEG)微球，使BMP在體外實驗中緩慢釋放，使細胞活性長期表達，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的聚已內酯(polycaprolactone，PCL)支架，為臨床應用新型BMP材料提供了實驗依據[63]。Ashraf和Gillgrass[64]進行了前瞻性Ⅱ期臨床試驗，對平均年齡為10.4歲的9例和2例分別因單側和雙側牙槽間隙接受手術治療的患者植入rhBMP-7，術后6個月行咬合X線檢查評價牙槽裂隙部位骨形成情況，隨訪10年，觀察BMP-7對正畸治療和上頜生長的影響，其中單側牙槽裂患者X線檢查結果顯示Kindelan評分為1或2級的患兒骨形成良好，移植成功的兒童接受了常規(guī)的正畸隨訪，上頜生長與自體骨移植效果相似，未見長期并發(fā)癥和骨形成模式異常，為rhBMP-7在兒童牙槽骨缺損重建中的應用提供了獨特的證據。

曲福軍等[65]構建轉染BMP-7基因組織工程軟骨，用以修復家兔膝關節(jié)軟骨缺損，在實驗中發(fā)現(xiàn)轉染與未轉染BMP-7基因組織工程軟骨對家兔膝關節(jié)軟骨缺損均有修復作用,但轉染BMP-7基因組織工程軟骨的修復作用更強。貝抗勝等[66]經研究證實BMP-7在體外可以促進和誘導骨膜細胞向成骨細胞分化。Schlickewei等[67]制備一種可作為生物活性骨替代材料的可注射DNA負載納米磷酸鈣糊劑，發(fā)現(xiàn)BMP-7和VEGF-A-編碼磷酸鈣納米粒DNA負載骨糊劑使兔模型中臨界大小骨缺損的愈合速度明顯加快。Chen等[68]在裸鼠實驗中將人BMP-7重組腺病毒穩(wěn)定轉染至人真皮源性成纖維細胞(human dermal-derived fibroblast cells，hDDFCs)中，發(fā)現(xiàn)腺病毒介導的BMP-7表達可促進hDDFCs的成骨分化，增強成骨細胞相關基因的表達，對hDDFC成骨有明顯促進作用，證實以BMP-7表達的腺病毒轉染hDDFC是一種有效的骨組織工程修復工具。

BMP-2、BMP-4和BMP-7的臨床應用基本都是以重組BMP載體等形式促進骨愈合，從而達到骨重建的目的。骨重建成功的關鍵在于術者操作的精細程度，將不愈合組織徹底切除，穩(wěn)定固定以及對骨的軸線、長度和扭轉的恢復，而BMP僅僅是促進骨折的愈合，并不能起到代替作用[69]。其中BMP-4在骨重建過程的主要作用是刺激骨硬化，起到對BMP-2和BMP-7的協(xié)同作用[70]。BMP-4在骨、眼、胃腸、心血管、神經系統(tǒng)甚至腫瘤等相關疾病中均有不同形式的表達[71],目前在骨科臨床應用較少，主要用于組織工程學方面的研究，現(xiàn)有研究結果有待進一步臨床實驗證實；BMP-2和BMP-7在骨重建中的主要作用是誘導MSC向成骨細胞分化，成骨分化受到由多個BMP組成的復雜網絡調控，在分化過程中存在選擇性的表達增加和減少，其中BMP-2是這一網絡的中央調節(jié)器[72-73]。在軟骨形成和成骨過程以及血管重建過程中，BMP-2的作用甚至被認為是必不可少的[74]。

四、小結

綜上所述，BMP在臨床骨重建中的應用主要是通過一系列的信號傳導誘導未分化MSC的基因表達，促使MSC分化為軟骨和新生骨，BMP家族成員相互協(xié)調、協(xié)同作用，從而達到促進骨重建的目的。BMP在骨折愈合過程中不僅能促進骨的生物學穩(wěn)定性，而且能起到骨支撐作用，從而成為臨床應用較多的骨修復材料。但是BMP存在降解快、成本高、所需劑量大以及可能導致溶骨、異位骨化和局部炎癥等諸多缺點，使其臨床應用受到限制。BMP-2在骨重建中的作用最重要，在臨床的應用也最為廣泛。但是，BMP-2合成材料存在不能長久緩慢釋放等缺點，還需要生物工程材料的改進。另外，BMP-9在骨修復重建中的作用優(yōu)于BMP-2，BMP-4在骨、眼、胃腸、心血管、神經系統(tǒng)甚至腫瘤等相關疾病中均有不同形式的表達，由此可見BMP家族仍存在更多的探索空間，伴隨著科技的進步以及多學科的協(xié)作，BMP家族可能被更多應用于臨床。目前大多數(shù)BMP相關研究仍處于動物實驗階段，如何使BMP在臨床應用中形成穩(wěn)定持續(xù)緩慢釋放的誘導物質，又不導致溶骨、炎癥以及異位骨化，從而促進骨折愈合和腱-骨愈合，最終完成促進骨重建的作用，尚需要更深入長久的多學科研究探索。