胰島素樣生長(zhǎng)因子ⅡmRNA 結(jié)合蛋白3 與膀胱癌相關(guān)蛋白BCA7 在膀胱癌中的表達(dá)及與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

程鈺，盧柳，程肇平

安康市中心醫(yī)院病理科，陜西 安康7250000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于 膀胱黏膜[1]。相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌發(fā)病率居西方國(guó)家位居第二，僅次于前列腺癌；中國(guó)膀胱癌發(fā)病率為6.61/10 萬(wàn)，居全部惡性腫瘤發(fā)病率的第九位。近年來(lái)，膀胱癌的發(fā)病率不斷上升，且隨著年齡增長(zhǎng)而升高，50～70 歲為高發(fā)年齡，發(fā)病人群男性多于女性，隨著吸煙人數(shù)的不斷增多，每年全球膀胱癌新發(fā)例數(shù)約35 萬(wàn)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[2-3]。研究表明，新發(fā)膀胱癌患者中，尿路上皮癌所占比例高達(dá)90%，非肌層浸潤(rùn)性占70%～80%，肌層浸潤(rùn)性占20%～30%，隨時(shí)間推移，部分非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者會(huì)發(fā)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌或復(fù)發(fā)，50%的肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者術(shù)后甚至出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5]。膀胱癌患者預(yù)后呈多變和無(wú)法預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，臨床尋求有效且準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)后的腫瘤特異性標(biāo)志物尤為重要。經(jīng)生物學(xué)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子ⅡmRNA 結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factorⅡmRNA binding protein 3，IMP3）與膀胱癌相關(guān)蛋白BCA7 蛋白在膀胱癌患者呈現(xiàn)高表達(dá)水平，在預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后方面可發(fā)揮作用[6]。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)IMP3 和膀胱癌相關(guān)蛋白BCA7 在膀胱癌患者中的表達(dá)，并分析其與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年6 月至2015 年6 月安康市中心醫(yī)院收治的膀胱癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為膀胱癌；腫瘤無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且術(shù)前未接受新輔助化療或放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心、肝、腎等臟器嚴(yán)重功能不全；合并凝血功能和精神障礙；臨床資料和隨訪資料缺失或不完整。采用世界衛(wèi)生組織（WHO）1973 分級(jí)法進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)，采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)2002 年TNM 分期法進(jìn)行臨床分期。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入121 例膀胱癌患者，男93 例，女28 例；年齡28～80 歲，平均（60.42±3.25）歲。取121 例膀胱癌患者的膀胱癌組織和32 例對(duì)應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本浸泡于10%甲醛中，石蠟包埋。

1.2 免疫組化法檢測(cè)IMP3與BCA7蛋白的表達(dá)情況

取121 例膀胱癌患者的膀胱癌組織和32 例相應(yīng)的癌旁正常組織，4 μm 厚石蠟切片，梯度乙醇常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鹽（pH=6.0）加熱抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次5 min，二甲苯脫蠟，每次15 min，于0.3%過(guò)氧化氫中孵育10 min后，PBS沖洗3次，每次5 min，胎牛血清封閉30 min。加入稀釋濃度為1∶100的兔單克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min，加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色、脫水、透明和固定。免疫組化染色操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：由兩名病理專(zhuān)家依照評(píng)分等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行免疫組化評(píng)分，BCA7 依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：依據(jù)染色強(qiáng)度，無(wú)染色計(jì)0分，弱染色計(jì)1 分，中等強(qiáng)度染色計(jì)2 分，強(qiáng)染色計(jì)3 分；依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為0%計(jì)0 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為1%～50%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%～75%計(jì)2 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為≥76%計(jì)3 分；將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，≤4 分為BCA7 低表達(dá)，≥5 分為高表達(dá)。IMP3 定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色或棕黃色染色為陽(yáng)性，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：依據(jù)染色強(qiáng)度，無(wú)染色計(jì)為0分，淡黃色染色計(jì)1 分，棕黃色染色計(jì)2 分，棕褐色染色計(jì)3分；依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≤5%計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為6%～25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為26%～50%計(jì)2 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≥51%計(jì)3分；將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，＞1分為陽(yáng)性，0～1分為陰性。

1.3 隨訪方法

采用電話、短信、回院復(fù)查和上門(mén)隨訪的方式對(duì)121 例膀胱癌患者進(jìn)行為期3 年的隨訪，隨訪時(shí)間10～60 個(gè)月，平均（27.40±14.80）個(gè)月，以患者死亡或隨訪結(jié)束為隨訪終點(diǎn)，隨訪截止時(shí)間為2018年6 月，記錄患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；IMP3 和BCA7 蛋白表達(dá)情況與膀胱癌患者預(yù)后的影響因素采用Logistic 回歸分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMP3 和BCA7 蛋白的表達(dá)情況

121 例膀胱癌患者膀胱癌組織中IMP3 陽(yáng)性表達(dá)率65.29%（79/121），高于癌旁正常組織的0%；121例膀胱癌患者膀胱癌組織中BCA7蛋白的高表達(dá)率為73.55%（89/121），低表達(dá)率為26.45%（32/121）。

2.2 不同臨床特征膀胱癌患者膀胱癌組織中IMP3和BCA7 蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑及腫塊數(shù)目膀胱癌患者膀胱癌組織中IMP3 和BCA7 蛋白表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同組織學(xué)分級(jí)、T 分期和復(fù)發(fā)情況膀胱癌患者膀胱癌組織中IMP3 蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.049、7.501、4.061，P＜0.05）。不同組織學(xué)分級(jí)、T 分期和復(fù)發(fā)情況膀胱癌患者膀胱癌組織中BCA7 蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.053、7.646、11.790，P＜0.05）。（表1）

2.3 不同IMP3 與BCA7 蛋白表達(dá)情況膀胱癌患者3 年生存率比較

IMP3 陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的3 年生存率為35.44%（27/79），低于陰性表達(dá)患者的65.62%（21/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.117，P=0.002）；BCA7 蛋白高表達(dá)宮頸癌患者的3年生存率為42.70%（38/89），低于低表達(dá)患者的59.38%（19/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.464，P=0.000）。

2.4 膀胱癌患者預(yù)后情況影響因素的單因素及多因素分析

經(jīng)單因素分析可見(jiàn)，組織學(xué)分級(jí)、T 分期、復(fù)發(fā)情況、IMP3 蛋白表達(dá)情況和BCA7 蛋白表達(dá)情況可能與膀胱癌患者的預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)、T分期為T(mén)2～T4期、IMP3 陽(yáng)性表達(dá)與BCA7 高表達(dá)是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表2）

3 討論

胰島素樣生長(zhǎng)因子家族mRNA 結(jié)合蛋白成員是RNA 結(jié)合蛋白IMP3?；蚝Y選法發(fā)現(xiàn)，IMP3在胰腺癌和良性胰腺組織中表達(dá)情況不同，為腫瘤組織表達(dá)的K 同源蛋白[8]。此外，IMP3 是一種分泌性蛋白，可結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF），對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、運(yùn)動(dòng)和黏附起調(diào)節(jié)作用，對(duì)IGF 與IGF2 型受體發(fā)揮作用，對(duì)凋亡抑制效應(yīng)、有絲分裂效應(yīng)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)起促進(jìn)作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展與IMP3 有關(guān)[11]。本研究采用免疫組化法檢測(cè)IMP3 蛋白在膀胱癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中IMP3 蛋白的表達(dá)高于癌旁正常組織，表明IMP3 蛋白在膀胱癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，此外，本研究結(jié)果顯示，IMP3 蛋白的表達(dá)可能與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、T 分期和復(fù)發(fā)情況有關(guān)，即腫瘤分級(jí)越高、T 分期越晚、腫瘤復(fù)發(fā)，IMP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率就越高，表明腫瘤的惡性程度與IMP3 表達(dá)情況有關(guān)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，IMP3 陽(yáng)性表達(dá)患者3 年生存率低于陰性表達(dá)患者，多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，IMP3 蛋白表達(dá)陽(yáng)性是膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步表明IMP3 表達(dá)參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，影響了膀胱癌患者的預(yù)后，IMP3 表達(dá)可作為預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

表1 不同臨床特征膀胱癌患者膀胱癌組織中IMP3 和BCA7 蛋白的表達(dá)情況（n=121）

表2 膀胱癌患者預(yù)后情況影響因素的單因素及多因素Logistic 回歸分析

目前，膀胱癌發(fā)病原因與機(jī)制尚不明確，但可知其與激活的原癌基因與失活的抑癌基因有關(guān)，在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。研究結(jié)果表明，患者的預(yù)后與多種腫瘤標(biāo)志物相關(guān)，如RNA結(jié)合基序蛋白3、脆性組氨酸三聯(lián)體、胞內(nèi)連接蛋白α、上皮型鈣黏蛋白和原鈣黏蛋白10 等[13～15]，但關(guān)于預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后生物分子標(biāo)志物的研究較少，這可能與尚未完全闡明的膀胱癌患者的具體發(fā)病機(jī)制有關(guān)。既往逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）驗(yàn)證及生物信息學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)，BCA7 已確定為膀胱癌高表達(dá)基因，癌旁正常組織中BCA7 mRNA水平明顯低于膀胱癌組織，全身其他正常組織中幾乎未發(fā)現(xiàn)BCA7 mRNA的表達(dá)，表明BCA7基因在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用，對(duì)膀胱癌患者的預(yù)后有預(yù)測(cè)作用[16～18]。本研究經(jīng)免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BCA7 蛋白在癌旁正常組織中的表達(dá)水平明顯低于膀胱癌組織，表明BCA7 蛋白在癌旁正常組織中低表達(dá)，在膀胱癌組織中高表達(dá)，符合既往mRNA 表達(dá)水平結(jié)果[19]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織學(xué)分級(jí)、T分期和復(fù)發(fā)情況與BCA7 蛋白表達(dá)水平有關(guān)，組織學(xué)分級(jí)越高、T分期越晚、腫瘤復(fù)發(fā)，BCA7 蛋白高表達(dá)率越高，這可能與膀胱癌惡性程度和基因表達(dá)情況有關(guān)，BCA7蛋白可作為膀胱癌的原癌基因。本研究比較BCA7蛋白高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的生存率，結(jié)果顯示，BCA7 蛋白高表達(dá)患者的生存率低于低表達(dá)患者，同時(shí)，多因素Logistic 回歸分析也發(fā)現(xiàn)，BCA7 蛋白表達(dá)水平是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明BCA7 蛋白高表達(dá)膀胱癌患者的預(yù)后較差，BCA7 蛋白在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用，可能為一個(gè)理想的膀胱癌預(yù)后標(biāo)志物[20]。

綜上所述，IMP3與BCA7蛋白在膀胱癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)情況與患者的預(yù)后相關(guān)，IMP3與BCA7蛋白可作為評(píng)估膀胱癌患者預(yù)后的有效標(biāo)志物。