微小RNA-137 調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用及機(jī)制研究

楊悅，南丁阿比雅思，王萱，李曉梅

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，哈爾濱1500000

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，且趨于年輕化。研究表明，腫瘤相關(guān)因子表達(dá)異常和功能改變直接影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，這也是目前研究的熱點(diǎn)[1-2]。磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是許多腫瘤最易缺失或突變的基因之一，有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 水平下降與乳腺癌侵襲表型及預(yù)后不良密切相關(guān)[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類于真核生物中廣泛存在的非編碼RNA，對靶基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，如對細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生命活動進(jìn)行調(diào)控。多種miRNA 異常表達(dá)于乳腺癌中，對miRNA 在乳腺癌中的功能及作用機(jī)制的深入研究有利于更好地認(rèn)知乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。近年來，miRNA-137與PTEN 關(guān)系的研究已相繼開展，Mohammad 等[6]在研究中探討了miRNA-137 通過抑制蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)PTEN 的過程，發(fā)現(xiàn)該調(diào)節(jié)過程影響了前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中H3K4 的去甲基化過程，并對前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了一定的影響。本實(shí)驗(yàn)從組織和細(xì)胞水平探討了miRNA-137 通過抑制PTEN 調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/AKT 信號通路對乳腺癌生物學(xué)行為的調(diào)控作用，旨在為尋找乳腺癌診斷及治療的新靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集2014 年3 月至2018 年1 月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放療、化療、免疫治療等其他抗腫瘤治療；經(jīng)手術(shù)病理確診；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；行乳腺假體植入。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入92 例乳腺癌患者，年齡26～55 歲，平均（49.5±5.7）歲；按照2003年世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的乳腺組織學(xué)分級及分類標(biāo)準(zhǔn)[7]對乳腺癌病例HE 染色切片進(jìn)行病理學(xué)分型和分級，其中，普通型浸潤性導(dǎo)管癌66 例，混合型癌20 例，浸潤性小葉癌6 例；組織學(xué)分級：Ⅰ級18 例，Ⅱ級44 例，Ⅲ級30 例。收集92 例乳腺癌患者的乳腺癌組織標(biāo)本及其癌旁正常組織標(biāo)本，所有樣本均以10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，其中，包括遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤組織標(biāo)本36 例。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)液、Trizol 試劑盒、實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、被動裂解液（passive lysis buffer，PLB）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測試劑盒、Transwell 小室均購自美國Sigma 公司；熒光素酶檢測試劑盒購自GeneCopoeia 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司。乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科保存。RM2255 型組織切片機(jī)購自北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司；MK3 型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Lab systems 公司；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV1700 型紫外分光光度計(jì)購自日本島津公司；MiniAmp Plus PCR 儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DYY-6C 型電泳儀購自北京六一儀器廠；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技公司；JY-SPFT 型核酸電泳成套設(shè)備購自大連競邁生物科技有限公司；JY-SCZ2 型蛋白電泳成套設(shè)備購自大連競邁生物科技有限公司；ELx800 型全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek 公司；FACS Vantage SE 型流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。ImageQuant LAS 500 生物分子成像儀購于美國Cytiva 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231（1×106/ml）分別置于12 孔培養(yǎng)板中，條件設(shè)置為37 ℃和5% CO2，置入DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)24 h，經(jīng)處理后孵育15 min，再于孔板中置入6 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后以同樣條件再次轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將3 種樣本細(xì)胞分別分為空白組（無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）、miRNA-NC 組（轉(zhuǎn)染無義序列）、miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miRNA-137 mimics）、miRNA-137 mimics+PTEN 轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miRNA-137 mimics+PTEN）。通過化學(xué)合成miRNA-137 特異性模擬物mimics 對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒均由病理科保存。利用microRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫及生物信息軟件對miRNA-137 與靶基因的相互作用進(jìn)行預(yù)測，判斷PTEN mRNA 3'UTR 的堿基是否存在miRNA-137 可能互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，預(yù)測miRNA-137 與PTEN 可能的作用位點(diǎn)位于PTEN 3'UTR 41-47 堿基（5'-ACUUGAA-3'）。構(gòu)建PTEN 野生型3'-UTR 熒光素酶質(zhì)粒pMIR-WT（WTPTEN）和PTEN 突 變 型 質(zhì) 粒pMIR- Mut（Mut-PTEN）。

熒光素酶報(bào)告基因法檢測熒光素酶活性。將pMIR-WT、pMIR-Mut、PTEN 模擬物與miRNA-137 mimics 和對照mimics 共轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞，24 h 后去除培養(yǎng)基，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞3 次后將其棄凈，各孔添加PLB 100 μl，于室溫下放置培養(yǎng)板于平板搖床上，微微晃動15 min。細(xì)胞裂解后，轉(zhuǎn)移各組中20 μl樣本至發(fā)光用96 孔板中，同時放置超級酶標(biāo)儀檢測板中，設(shè)置自動進(jìn)樣器1、2 分別分裝LARⅡ和Stop&Glo 試劑各100 μl。通過1～2 s 延遲、5～10 s讀數(shù)進(jìn)行測量。循環(huán)操作，直至檢測完所有樣本，之后將其結(jié)果通過酶標(biāo)儀配套軟件進(jìn)行分析。熒光素酶相對活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染后基因測序均由上海生工生物工程公司完成。

1.5 qRT-PCR 檢測miRNA-137 表達(dá)水平

采用qRT-PCR 檢測細(xì)胞、組織中miRNA-137的表達(dá)水平。按照Trizol 試劑盒說明書中步驟提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄總RNA，繼而合成cDNA，根據(jù)qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)。以Ct 值形式得到qRT-PCR 結(jié)果，同時擴(kuò)增所有樣本中靶基因miRNA 和內(nèi)參U6，反應(yīng)體系為20 μl。每個樣本重復(fù)3 次。

1.6 驗(yàn)證蛋白水平

Western blot 檢測PTEN、p-AKT 308、p-AKT 473、AKT 蛋白的表達(dá)情況：將乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 通過RIPA 細(xì)胞裂解液加以裂解，采用BAC 法測量其濃度，通過上樣緩沖液調(diào)齊細(xì)胞濃度，每孔上樣40 μg。先以120 V 電壓進(jìn)行電泳，待Marker 到達(dá)濃縮膠與分離膠交界處時，將電壓轉(zhuǎn)換至150 V，持續(xù)至Marker 完全分開。按照Marker 指示，將對應(yīng)目的蛋白位置的凝膠及GAPDH 相對應(yīng)的凝膠切下。置蛋白于濕轉(zhuǎn)儀器中，于恒流300 mA 下轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。然后置PVDF 膜于5%封閉液（5%脫脂牛奶）中在37℃下封閉2 h。PTEN 一抗稀釋比例為1∶500，p-AKT 308、p-AKT 473、AKT 一抗稀釋比例均為1∶1000，將PVDF 膜封閉好，于4 ℃下與一抗孵育過夜。為使蛋白與一抗充分混勻，1 天后，于37 ℃下將其置入搖床中振動2 h，TBST 洗膜4 次，每次8 分鐘，將膜與二抗（稀釋比例為1∶5000）浸泡，置入搖床于37 ℃下振動1.5 h。根據(jù)電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑說明書，于Image Quant LAS 500 儀器中檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 驗(yàn)證細(xì)胞水平

1.7.1 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 的侵襲能力。將其制成單細(xì)胞混懸液，然后接種至Transwell小室上室中。將Transwell 小室底部膜的上室面于50 mg/L Matrigel 采用稀釋液（比例為1∶8，無血清培養(yǎng)基）加以包被，4 ℃下風(fēng)干，將培養(yǎng)板中殘余液體吸出，于37 ℃下各孔加入300 μl 無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 min。將細(xì)胞無血清“饑餓”處理12～24 h 后制備細(xì)胞懸液，以去除血清的影響。待消化終止后離心棄去培養(yǎng)液，將其以PBS 清洗1～2 次，同時置于含1%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）的無血清培養(yǎng)基中重懸。將細(xì)胞密度調(diào)整為（1～5）×105/ml，將200 μl 的細(xì)胞懸液去除置入Transwell 小室，將500 μl 含胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基加至24 孔板下室中，培養(yǎng)12～49 h，接種細(xì)胞后1 h 檢查確認(rèn)無大氣泡產(chǎn)生后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，采用0.1%蘇木素-伊紅染色。通過倒置顯微鏡對不同細(xì)胞系移至下室的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7.2 CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 將無義序列、miRNA-137 mimics、miRNA-137 mimics+PTEN分別轉(zhuǎn)染至低侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，將2×103個細(xì)胞鋪于96 孔板中，分別于0、24、48、72 h 加入CCK8 10 μl，置入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，4 h 后，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的光密度（optical density，OD）值，并繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將4×105個細(xì)胞（MCF-7、MDA-MB-231）鋪置于12 孔板中，后置入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，等細(xì)胞過夜貼壁且長滿后，用10 μl槍頭劃痕，除去培養(yǎng)基，PBS清洗數(shù)次后加入無血清培養(yǎng)基，分別于0、24 h于相同位置拍照，采用ipwin 32軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活力 將10 cm 培養(yǎng)皿的細(xì)胞收集，70%乙醇固定，40 ℃下過夜。染色前，重新收集細(xì)胞，PBS 重新靜置，PI 溶液染色細(xì)胞，37 ℃下孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)，采用BD FACSuite TM 軟件分析數(shù)據(jù)，檢測細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞（MCF-7、MDA-MB-231）活力的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織和細(xì)胞中miRNA-137表達(dá)水平的比較

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miRNA-137 的表達(dá)水平為（2.91±0.36），明顯高于癌旁正常組織的（1.00±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.224，P＜0.01）。發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中miRNA-137 的表達(dá)水平為（2.19±0.37），明顯高于未發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移乳腺癌組織的（1.00±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.365，P＜0.01）。乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 中miRNA-137 的表達(dá)水平分別為（1.00±0.14）、（1.66±0.20）、（2.85±0.30），3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.331，P＜0.01）。MCF-7、MDA-MB-231 細(xì)胞中miRNA-137 的表達(dá)水平均明顯高于MCF-10A 細(xì)胞，差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（t=4.683、9.679，P ＜0.01）。對于MCF-7 細(xì)胞，miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組miRNA-137 的表達(dá)水平為（6.56±0.10），明顯高于miRNA-NC 組的（1.01±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=95.652，P＜0.01）。

2.2 乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的比較

Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的侵襲數(shù)目為（438.77±14.77）個，明顯多于MCF-7 的（176.95±10.79）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.792，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測不同乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力（蘇木素-伊紅染色，×200）

2.3 miRNA-137 靶向調(diào)控PTEN mRNA 的表達(dá)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PTEN mRNA 3'UTR 的堿基存在與miRNA-137 可能互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，提示PTEN 是miRNA-137 可能作用的靶基因。

2.4 miRNA-137 結(jié)合PTEN mRNA 3'UTR 堿基抑制PTEN 的表達(dá)

熒光素酶報(bào)告基因法檢測結(jié)果顯示，對于WTPTEN 野生型報(bào)告基因質(zhì)粒，miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性為（3.95±0.22），明顯低于miRNA-NC 組的（6.16±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.580，P＜0.01）。對于Mut-PTEN 突變型報(bào)告基因質(zhì)粒，miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性為（7.13±0.10），與miRNA-NC 組的（7.01±0.17）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Western blot檢測結(jié)果顯示，miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組PTEN 蛋白的相對表達(dá)量為（0.60±0.05），明顯低于miRNA-NC 對照組的（2.01±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=47.895，P＜0.01）。（圖2）

圖2 Western blot檢測不同組別PTEN蛋白的相對表達(dá)量

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組PTEN mRNA 的表達(dá)水平為（0.39±0.04），明顯低于miRNA-NC 組的（1.01±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.045，P＜0.01）。

2.5 不同組織和細(xì)胞中PTEN mRNA 及蛋白的表達(dá)情況

乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 中PTEN mRNA 的表達(dá)水平分別為（1.00±0.11）、（0.79±0.12）、（0.79±0.12），3 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。乳腺癌組織中PTEN mRNA 的表達(dá)水平為（0.47±0.05），明顯低于癌旁正常組織的（1.02±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.816，P＜0.01）。Western blot 檢測結(jié)果顯示，乳腺癌組織中PTEN 蛋白的相對表達(dá)量為（0.47±0.05），明顯低于癌旁正常組織的（2.04±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=102.781，P＜0.01）（圖3）。

圖3 Western blot檢測不同組織中PTEN蛋白的相對表達(dá)量

2.6 miRNA-137 與PTEN 調(diào)控不同侵襲能力乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為

不同組別MCF-7 細(xì)胞的OD 值、S 期細(xì)胞比值、侵襲細(xì)胞數(shù)目、遷移細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞遷移距離比較，差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（F=49.345、46.678、221.615、502.389、21.367，P ＜0.01）。不 同 組 別MDA-MB-231 細(xì)胞的OD 值、S 期細(xì)胞比值、細(xì)胞侵襲數(shù)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移距離比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.750、126.943、241.52、11.408、39.185，P＜0.01）。miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組的上述各指標(biāo)均高于miRNA-NC 組，而miRNA-137 mimics+PTEN 轉(zhuǎn)染組的上述各指標(biāo)均低于miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1、表2）

2.7 miRNA-137 與PTEN 通 過 調(diào) 節(jié)PI3K/AKT 信號通路調(diào)控乳腺癌的生物學(xué)行為

Western blot 檢測結(jié)果顯示，不同組別MCF-7細(xì)胞中PTEN、p-AKT 308、p-AKT 473 蛋白的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.188、29.223、54.026，P＜0.01）；不同組別MCF-7 細(xì)胞中AKT 蛋白的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組中PTEN、p-AKT 308、p-AKT 473 蛋白的表達(dá)水平均高于miRNA-NC 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miRNA-137 mimics+PTEN轉(zhuǎn)染組PTEN、p-AKT 308、p-AKT 473 蛋白的表達(dá)水平均低于miRNA-137 mimics 轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3、圖4）

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，也是女性惡性腫瘤死因的前三位惡性腫瘤之一[8]。轉(zhuǎn)移是乳腺癌病死率高的主要危險(xiǎn)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)移后的病死率居乳腺癌死亡總?cè)藬?shù)的90%以上[9]。惡性程度、增長速度亦是乳腺癌預(yù)后差的危險(xiǎn)因素。因此，探索與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及增殖相關(guān)的分子標(biāo)志物對于提高乳腺癌的確診率以及為患者提供確切、有效的治療方案至關(guān)重要[10]。

圖4 不同組別PTEN、p-AKT308、p-AKT473、AKT蛋白的表達(dá)水平

miRNA 屬于非編碼小RNA 家族，其通過部分序列互補(bǔ)的方式與目標(biāo)基因mRNA 的3'UTR 區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。由于其目標(biāo)蛋白在某些信號通路中的重要功能，miRNA 已成為基因調(diào)節(jié)的重要目標(biāo)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 可作為抑癌或促癌因素參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，部分miRNA 的表達(dá)異常與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有直接的關(guān)系[11-15]。Zhang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-205 可以靶向調(diào)節(jié)ErbB3、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞增長和遷移的抑制作用。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-93 在三陰性乳腺癌中呈高表達(dá)。黃秀芳[18]應(yīng)用miRNA微陣列技術(shù)研究了乳腺癌miRNA的差異表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-137、miRNA-497、miRNA-21、miRNA-155 等miRNA 的表達(dá)異常可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來，miRNA-497、miRNA-21、miRNA-155 等miRNA 與乳腺癌的相關(guān)性研究已逐漸成熟，關(guān)于miRNA-137 與乳腺癌的研究還未見報(bào)道。本研究分別從組織水平和細(xì)胞水平探討了miRNA-137 與乳腺癌細(xì)胞之間的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中的miRNA-137的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中miRNA-137 的表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織。可見乳腺癌與miRNA-137 表達(dá)異常之間的關(guān)系密切。

表1 不同組別MCF-7 細(xì)胞OD 值、S 期細(xì)胞比值、侵襲細(xì)胞數(shù)目、遷移細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞遷移距離的比較（±s）

表1 不同組別MCF-7 細(xì)胞OD 值、S 期細(xì)胞比值、侵襲細(xì)胞數(shù)目、遷移細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞遷移距離的比較（±s）

注：a與miRNA-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05

指標(biāo)OD值S期細(xì)胞比值（%）侵襲細(xì)胞數(shù)目（/HP）遷移細(xì)胞數(shù)目（/HP）細(xì)胞遷移距離（mm）miRNA-NC組1.66±0.04 14.60±1.27 146.30±10.17 159.33±8.25 12.71±1.39 miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組2.47±0.12a 20.67±1.20a 305.33±9.24a 290.00±3.21a 27.42±3.30a miRNA-137 mimics+PTEN轉(zhuǎn)染組0.95±0.14b 6.91±0.07b 70.33±2.40b 46.67±3.18b 8.92±0.75b

表2 不同組別MDA-MB-231 細(xì)胞OD 值、S 期細(xì)胞比值、侵襲細(xì)胞數(shù)目、遷移細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞遷移距離的比較（±s）

表2 不同組別MDA-MB-231 細(xì)胞OD 值、S 期細(xì)胞比值、侵襲細(xì)胞數(shù)目、遷移細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞遷移距離的比較（±s）

注：a與miRNA-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05

指標(biāo)OD值S期細(xì)胞比值（%）侵襲細(xì)胞數(shù)目（/HP）遷移細(xì)胞數(shù)目（/HP）細(xì)胞遷移距離（mm）miRNA-NC組1.23±0.16 18.55±1.20 165.33±5.93 187.67±17.29 13.30±1.26 miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組2.03±0.15a 26.16±1.12a 355.00±14.73a 293.33±51.52a 22.95±1.59a miRNA-137 mimics+PTEN轉(zhuǎn)染組0.85±0.12b 13.21±1.46b 70.00±3.06b 80.67±4.41b 7.71±0.67b

表3 不同組別MCF-7 細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表3 不同組別MCF-7 細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與miRNA-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05

蛋白PTEN p-AKT 308 p-AKT 473 AKT miRNA-NC組46.10±2.97 17.90±0.60 25.33±1.48 26.53±1.28 miRNA-137 mimics轉(zhuǎn)染組17.43±1.07a 31.43±2.14a 42.27±1.24a 26.33±0.61 miRNA-137 mimics+PTEN轉(zhuǎn)染組46.93±2.38b 17.82±1.17b 26.37±1.13b 26.58±0.33

PTEN 是一種腫瘤抑制基因，具有抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲等功能，在乳腺癌發(fā)病中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 也可作為評價(jià)乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)，在乳腺癌組織從癌前病變向乳腺癌演變的過程中有重要作用，其表達(dá)與乳腺癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，同時，PTEN 蛋白的低表達(dá)可直接影響乳腺癌的發(fā)生，其原因可能是PTEN 的功能缺失，降低了其對腫瘤細(xì)胞生長及黏附的抑制和調(diào)控作用，提高了乳腺癌的發(fā)病率[19-21]。本研究也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中PTEN mRNA 的表達(dá)水平均明顯低于乳腺上皮細(xì)胞，乳腺癌組織中PTEN mRNA 及蛋白的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，證實(shí)了PTEN 對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的抑制作用。

本研究通過生物信息軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)PTEN mRNA 3'UTR 的堿基存在與miRNA-137 可能互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，提示PTEN 是miRNA-137 可能作用的靶基因，miRNA-137 可能通過對PTEN 的抑制作用發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞的相應(yīng)生物學(xué)作用。本研究通過相應(yīng)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了miRNA-137 能夠抑制PTEN蛋白的表達(dá)。PTEN 的過表達(dá)能夠抑制miRNA-137 對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的促進(jìn)作用。為了探索miRNA-137 通過抑制PTEN 表達(dá)從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體作用機(jī)制，本研究將PI3K/AKT 信號通路作為主要研究內(nèi)容，這是由于PI3K/AKT 信號通路可調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖及轉(zhuǎn)移等[22-23]。然而，多種miRNA 通過PI3K/AKT 信號通路影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的研究已相對成熟[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，若上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miRNA-137 的表達(dá)，p-AKT 308、p-AKT 473 蛋白的表達(dá)量隨之明顯升高，而AKT 蛋白的表達(dá)量卻無明顯變化。若將MCF-7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-137 mimics 和PTEN，p-AKT 308、p-AKT 473 蛋白的表達(dá)量恢復(fù)至原水平，而PTEN 也逆轉(zhuǎn)了miRNA-137 對PI3K/AKT 信號通路的影響。提示miRNA-137 可能通過抑制PTEN 調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路的活性。進(jìn)一步關(guān)于乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖的研究也證實(shí)了PI3K/AKT 通路對乳腺癌的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究充分闡述了miRNA-137 對乳腺癌的調(diào)控機(jī)制，PTEN 對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用，而miRNA-137 通過抑制PTEN 的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，同時通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路促進(jìn)乳腺癌的生物學(xué)行為，因此，miRNA-137 有可能成為乳腺癌診斷及治療的新靶點(diǎn)。