Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子8 在乳腺癌中的研究進(jìn)展△

翟秧秧，師鑫鵬，羅曉勇#

1鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院放療科，河南 洛陽471009

2洛陽市腫瘤臨床診療研究中心，河南 洛陽4710090

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是中國女性主要的腫瘤死亡原因[1]。在中國，乳腺癌的年齡標(biāo)化死亡率己達(dá)5.7/10 萬[2]?，F(xiàn)階段乳腺癌的治療方法主要是手術(shù)為主的綜合治療，包括放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向藥物治療等。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌患者即使接受手術(shù)治療或放化療，5 年內(nèi)仍有60%～70%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一[3]。目前認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及腫瘤細(xì)胞自身生長優(yōu)勢，細(xì)胞間黏附能力降低，細(xì)胞骨架重構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動、遷移，細(xì)胞凋亡、免疫殺傷和腫瘤血管、淋巴管形成等多種因素，加重了其治療難度[4]。因此，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制成為近年來研究的熱點(diǎn)，Krüpple 樣轉(zhuǎn)錄因子8（Krüppel like factor 8，KLF8）作為具有雙重調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子越來越得到人們的重視。本文就KLF8 的生物學(xué)功能及其在乳腺癌中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 KLF8 的生物學(xué)功能

Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子（Krüppel like factor，KLF）是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)（即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域）的基本轉(zhuǎn)錄因子，主要參與識別并結(jié)合DNA 序列中的CACCC 元件，它能夠結(jié)合DNA 中的CC 盒或相關(guān)的CACCC 元件，進(jìn)而調(diào)控富含CC 啟動子的基因表達(dá)[5-6]。KLF8 與KLF 家族的其他成員結(jié)構(gòu)相似，在羧基端含有3 個(gè)保守的C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)，在氨基端含有可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。此外，KLF8 還通過蛋白相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。

1.1 KLF8 對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，在整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用[7]。Zhao 等[8]研究分析了FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，而KLF8 基因是FAK 的特異性靶標(biāo)，其表達(dá)受FAK 信號通路的正調(diào)控。該研究采用免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF8 表達(dá)增加可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期，而KLF8-siRNA 可減緩細(xì)胞周期進(jìn)程。該研究還發(fā)現(xiàn)，KLF8 可通過直接結(jié)合cyclin D1 啟動子區(qū)域的GT 盒激活其表達(dá)。Wei 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，KLF8 可以直接結(jié)合cyclin D1 啟動子的GT 盒，從而激活其表達(dá)，KLF8 的泛素化降低了其介導(dǎo)的G1期細(xì)胞周期進(jìn)程。Yi 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，KLF8 在胰腺癌細(xì)胞系和組織中呈高表達(dá)，敲除KLF8 可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞G2/M 期阻滯，周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）/細(xì)胞分裂周期蛋白2（cell division cycle 2，CDC2）、細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）和cyclin D1 表達(dá)下調(diào)，而p21 和p27 表達(dá)上調(diào)。

1.2 KLF8 在血管生成中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，在高表達(dá)KLF8 的SMMC7721 肝癌細(xì)胞中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素2（angiopoietin 2，Ang2）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）的mRNA 表達(dá)水平增加，而VEGF、Ang2、HIF-1α和MMP2 在腫瘤的血管生成中具有至關(guān)重要的作用[11-13]。HIF-1α通過結(jié)合VEGF 啟動子區(qū)域的低氧反應(yīng)元件（hypoxic response element，HRE），在乏氧腫瘤細(xì)胞中上調(diào)VEGF 的表達(dá)[14]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，MMP2 和MMP9 可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中VEGF 的釋放[15]。李旭等[11]將KLF8 基因轉(zhuǎn)染至人肝癌SMMC7721 細(xì)胞中，通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測細(xì)胞中HIF-1α、VEGF、血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）、Ang2、血管生成素受體Tie2 及MMP2 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，KLF8 可能通過調(diào)控VEGF、Ang2、HIF-1α、MMP2 的表達(dá)來調(diào)控血管生成。Cheng 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中KLF8 可通過結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A（vascular endothelial growth factor，VEGFA）啟動子的CACCC 區(qū)域，上調(diào)VEGFA mRNA 的表達(dá)，此外，KLF8 還可以調(diào)控HIF-1α的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KLF8 在肝細(xì)胞癌中可通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路誘導(dǎo)VEGFA 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤血管新生。

1.3 KLF8 在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細(xì)胞從無創(chuàng)狀態(tài)發(fā)展為侵入狀態(tài)的決定性步驟，其主要特征包括細(xì)胞黏附分子（如E-鈣黏素）表達(dá)減少、細(xì)胞角蛋白為主的細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白（vimentin）為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等。為研究KLF8 與腫瘤EMT 的關(guān)系，Wang 等[17]在幾乎無內(nèi)源性KLF8 表達(dá)的MDCK 犬腎上皮細(xì)胞和MCF-10A 人乳腺上皮細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染KLF8，免疫印跡檢測結(jié)果顯示，上皮標(biāo)志蛋白E-鈣黏素表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-鈣黏素、波形蛋白表達(dá)升高，提示KLF8 在MDCK 和MCF-10A 上皮細(xì)胞中均可誘導(dǎo)EMT。該研究進(jìn)一步進(jìn)行啟動子熒光素酶報(bào)告基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF8 通過直接與E-鈣黏素基因啟動子中的GT 盒結(jié)合來抑制其表達(dá)。

1.4 KLF8 在脂肪細(xì)胞分化中的作用

KLF 家族作為含鋅指蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞分化和增殖中發(fā)揮了重要作用。Lee 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除KLF8 基因后可顯著減弱脂肪細(xì)胞分化。此外，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα）作為多效性轉(zhuǎn)錄激活因子，可協(xié)同誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，從而形成成熟的脂肪細(xì)胞。熒光素酶檢測結(jié)果顯示，KLF8 過表達(dá)誘導(dǎo)了PPARγ和C/EBPα的轉(zhuǎn)錄活性，說明KLF8是PPARγ和C/EBPα的上游調(diào)控因子，提示KLF8 在脂肪細(xì)胞早期分化中具有重要作用。KLF 家族的其他成員也被證實(shí)在脂肪分化中具有重要作用，如KLF5、KLF6 和KLF15 均被證明能夠促進(jìn)脂肪形成[19-21]，KLF15 還能夠上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達(dá)[21]。KLF3、KLF4 在脂肪形成中的作用也已經(jīng)被證實(shí)，其中KLF3 通過招募C-末端結(jié)合蛋白（C-terminal binding protein，CTBP）輔助抑制因子抑制脂肪細(xì)胞分化[22]，KLF4 基因敲除后阻止了脂肪的分化，但KLF4 并非脂肪分化的必要條件[23]。KLF 家族對脂肪分化的調(diào)節(jié)使其在肥胖控制中的作用逐漸引起人們的注意。

2 KLF8 在乳腺癌中的作用

KLF8 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用見圖1。

圖1 KLF8在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1 KLF8 與乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系

KLF8 是EMT 和腫瘤侵襲的重要誘導(dǎo)因子，除了通過抑制E-鈣黏素轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)EMT，KLF8 對細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著巨大的作用。MMP9、MMP14 均是MMP 成員，腫瘤細(xì)胞利用MMP 的蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而使腫瘤細(xì)胞以循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的形式存活下來，并在遠(yuǎn)處定植。研究發(fā)現(xiàn)，KLF8 可直接結(jié)合并激活人MMP9、MMP14基因啟動子促進(jìn)其表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[24-25]。

上皮基質(zhì)相互作用蛋白1（epithelial stromal interaction 1，EPSTI1）在侵襲性乳腺癌中高表達(dá)。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，EPSTI1 異位表達(dá)可使MCF-7 細(xì)胞具有乳腺浸潤性生長和肺轉(zhuǎn)移的能力，EPSTI1 是KLF8 轉(zhuǎn)錄激活的新靶點(diǎn)，通過激活含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）依賴性核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）而在乳腺癌的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。C-X-C 型趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）是C-X-C 型趨化因子配體12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）的受體，CXCR4 過表達(dá)與乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)[27-29]。研究發(fā)現(xiàn)，在浸潤性乳腺癌中，KLF8 通過直接結(jié)合CXCR4 基因啟動子促進(jìn)其表達(dá)，CXCL12 與CXCR4 的結(jié)合可導(dǎo)致FAK 激活，而FAK 作為KLF8 的上游誘導(dǎo)因子進(jìn)一步促進(jìn)KLF8 的表達(dá)，從而形成了正反饋循環(huán)[30]。這些研究結(jié)果表明，由KLF8、CXCR4 和FAK 組成的正反饋循環(huán)對促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移具有關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，KLF8 除了通過抑制E-鈣黏素的表達(dá)促進(jìn)EMT，還通過直接結(jié)合MMP9、MMP14、EPSTI1、CXCR4 基因啟動子并促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

2.2 KLF8 與乳腺癌細(xì)胞干性的關(guān)系

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是一種具有自我更新、分化能力的腫瘤細(xì)胞亞群，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對各種治療方法產(chǎn)生抵抗的重要原因[31]。Wang 等[32]研究將乳腺細(xì)胞干性與腫瘤轉(zhuǎn)化聯(lián)系起來，使用四環(huán)素誘導(dǎo)KLF8 表達(dá)的MCF-10A 細(xì)胞系，驗(yàn)證其EMT 特性后，采用流式細(xì)胞儀檢測人乳腺干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44 高表達(dá)/CD24 低表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)KLF8 的表達(dá)時(shí)，超過90%的細(xì)胞獲得CD44 高表達(dá)/CD24 低表達(dá)模式，而未誘導(dǎo)KLF8 表達(dá)的細(xì)胞中只有33%的細(xì)胞獲得此模式，提示KLF8 可通過EMT 誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞干性。此外，因微小RNA（microRNA，miRNA）參與了乳腺細(xì)胞干性的調(diào)節(jié)[33]，Wang 等[32]還通過檢測過表達(dá)KLF8 的細(xì)胞中miRNA 的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-146a 在浸潤性乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231、Hs578T 和BT-549）中的表達(dá)顯著上調(diào)，而在非浸潤性乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 和T47-D）中的表達(dá)未上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a 可能通過抑制Notch 信號抑制物NUMB蛋白的表達(dá)，在誘導(dǎo)EMT 和維持乳腺癌細(xì)胞干性中發(fā)揮重要作用。

2.3 KLF8 與乳腺癌化療耐藥的關(guān)系

在正常細(xì)胞分裂的過程中有多種DNA 修復(fù)機(jī)制來保持基因組的完整性。DNA 損傷對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用使得DNA 損傷劑成為腫瘤治療的主力軍。細(xì)胞毒性藥物如多柔比星、環(huán)磷酰胺和柔紅霉素可導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生DNA 單鏈斷裂（single strand break，SSB），未能修復(fù)SSB 將導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。SSB 和DSB 主要由多腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1]和乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）或DNA 依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）修復(fù)，細(xì)胞中異常高水平的DNA 修復(fù)功能不僅可增加對細(xì)胞毒性藥物的耐藥性，而且由于DNA 修復(fù)不當(dāng)導(dǎo)致的基因組和染色體不穩(wěn)定性也可能增加細(xì)胞的惡性程度。研究發(fā)現(xiàn)，在多柔比星處理的乳腺癌細(xì)胞中，KLF8 與PARP-1 和DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）相互作用并受其調(diào)控，提示KLF8 可能參與SSB 和DSB 修復(fù)過程，該研究明確地將KLF8 促進(jìn)DNA 修復(fù)與細(xì)胞對多柔比星耐藥聯(lián)系起來[34]。

2.4 KLF8 與乳腺癌表皮生長因子受體信號通路的關(guān)系

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）常常在侵襲性乳腺癌（如三陰性乳腺癌）中過表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。Li 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在非腫瘤性乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A 中，KLF8 的過表達(dá)可誘導(dǎo)EGFR 表達(dá)，而在侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 中，敲除KLF8 基因可降低EGFR 的表達(dá)。啟動子激活和結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KLF8 可以通過直接結(jié)合并激活EGFR 啟動子促進(jìn)EGFR 的表達(dá)，同時(shí)KLF8 還可以通過抑制miRNA-141 啟動子，從而抑制其表達(dá)；而miRNA-141 可靶向EGFR 的3'非翻譯區(qū)，從而抑制EGFR 的翻譯，即KLF8通過抑制miRNA-141的表達(dá)間接促進(jìn)了EGFR的表達(dá)。以上結(jié)果提示KLF8-miRNA-141/EGFR信號通路在乳腺癌的惡性進(jìn)展中具有重要作用。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，KLF8 作為具有雙重調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、血管生成、EMT及脂肪細(xì)胞分化，還能夠通過促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移、維持乳腺癌細(xì)胞干性、促進(jìn)化療耐藥及EGFR 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于KLF8在乳腺癌中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，且目前尚未有研究針對KLF8 表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，這為下一步的研究提供了思路。