SERS結(jié)合快速前處理檢測(cè)綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留

朱曉宇， 艾施榮， 熊愛華， 杜 娟， 黃俊仕， 劉 鵬， 胡 瀟， 吳瑞梅*

1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045 2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 江西 南昌 330045 3. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)計(jì)算機(jī)信息與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045

引 言

茶葉是中國的主要經(jīng)濟(jì)作物之一。 茶葉種植過程中由于農(nóng)藥使用不合理， 導(dǎo)致茶葉中農(nóng)殘超標(biāo)。 毒死蜱是一種廣譜性有機(jī)磷農(nóng)藥， 常用于防治水稻、 小麥、 茶樹等病害蟲， 具有胃毒觸殺性。 毒死蜱對(duì)人體神經(jīng)中乙酰膽堿酯酶有抑制作用， 導(dǎo)致一系列中毒癥狀， 嚴(yán)重者會(huì)死亡。 目前， 農(nóng)藥殘留常采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、 高效液相色譜法(HPLC)、 液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)等[1-3]經(jīng)典方法檢測(cè)， 這些方法的儀器昂貴、 對(duì)操作人員技術(shù)要求高、 前處理復(fù)雜。 也有采用生物傳感器法、 酶聯(lián)免疫等[4, 5]快速檢測(cè)方法， 但易受環(huán)境影響出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS)是指待測(cè)分子吸附在具有粗糙表面的金、 銀等金屬表面， 將待測(cè)物分子拉曼信號(hào)增強(qiáng)106～109倍， 從而提高檢測(cè)靈敏度[6]， 具有檢測(cè)速度快、 樣品制備簡單、 靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)， 廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)[7-9]。 翟晨等[10]以銀溶膠為增強(qiáng)基底， 研究菠菜中毒死蜱農(nóng)藥殘留的SERS快速檢測(cè)方法， 最低檢出濃度為0.05 mg·kg-1。 Liu等[11]采用SERS研究玉米中甲基異柳磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法， 最低檢出濃度為0.01 μg·g-1。 Luo等[12]以銀溶膠為增強(qiáng)基底， 用于蘋果表皮亞胺硫磷和噻菌靈農(nóng)藥殘留分析， 最低檢出濃度分別為0.5和0.1 μg·g-1。

對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣本， 前處理是分析檢測(cè)農(nóng)殘的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 茶葉中含有大量植物色素、 有機(jī)酸、 生物堿、 蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)， 這些物質(zhì)在檢測(cè)過程中會(huì)對(duì)農(nóng)藥分子拉曼信號(hào)產(chǎn)生影響。

課題組前期研究采用四氧化三鐵和石墨化碳去除綠茶中的葉綠素等基質(zhì)效應(yīng)， 提高了方法的檢測(cè)靈敏度[13]。 本文進(jìn)一步探索納米竹炭(NBC)凈化劑去除綠茶基質(zhì)效應(yīng)的效果， 研究綠茶基質(zhì)快速前處理方法， 與SERS結(jié)合， 對(duì)綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)。 利用乙腈提取茶葉提取液， 研究不同用量NBC凈化劑去除綠茶基質(zhì)影響， 尋求一種快速、 高效、 簡單的綠茶中農(nóng)殘SERS快速前處理方法， 以提高方法檢測(cè)精度， 建立綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的SERS快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

RamTracer-200-HS便攜式拉曼光譜儀(歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司)， JW-1024離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)， VORTEX-5渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司)， ZNCL-T智能恒溫磁力攪拌器(鄭州市亞榮儀器有限公司)， FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)， Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡(Hitachi Company)， 紫外-可見分光光度計(jì)(北京浦西通用儀器有限公司)。

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品(99.4%， Sigma-Aldrich公司)， 氯金酸(分析純， 1 g， 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)， 超純水， 乙腈(色譜純)、 無水硫酸鎂(98.0%， 分析純)、 氯化鈉(99.5%， 分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 濾膜(13 mm， 0.22 μm， 美國Agilent公司)， 檸檬酸三鈉(99.0%， 分析純， 西隴化工股份有限公司)， 納米竹炭(NBC粒徑100 nm， 上海海諾炭業(yè)有限公司)， 陰性綠茶樣本由江西出入境檢驗(yàn)檢疫局提供(農(nóng)藥殘留均在國家標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi))。

1.2 金納米增強(qiáng)基底制備及其表征

采用經(jīng)典檸檬酸鈉還原HAuCl4方法制備金納米增強(qiáng)基底[14]。 制備過程如下： 將質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸鈉3.7 mL溶液一次性加入到濃度為1 mmol·L-1100 mL沸騰的氯金酸溶液中， 繼續(xù)加熱并劇烈攪拌20 min， 得到紅棕色懸浮液， 自然冷卻到室溫， 備用。

1.3 NBC用量優(yōu)化

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 新型凈化劑納米竹炭(NBC)能有效去除綠茶的基質(zhì)影響， 本研究以NBC為凈化劑， 通過基質(zhì)加標(biāo)方法對(duì)不同用量NBC填料進(jìn)行篩選， 并對(duì)比不同用量NBC的實(shí)驗(yàn)效果。

提?。?稱取2.00 g干茶葉粉末于50 mL離心管中， 加入10 mL乙腈， 震蕩渦旋2 min后， 4 500 r·min-1離心5 min。 將毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液與綠茶上清液以一定比例混合， 渦旋1 min， 混合均勻。

凈化： 稱取NBC 0， 10， 15， 20， 25和30 mg于6個(gè)10 mL離心管中， 分別加入200 mg無水硫酸鎂； 取2 mL上述提取液分別加入到上述5個(gè)離心管中， 渦旋1 min后， 4 500 r·min-1離心5 min， 過0.22 μm濾膜， 上機(jī)檢測(cè)。

1.4 毒死蜱拉曼光譜理論計(jì)算

采用密度泛函理論(density functional theory， DFT)模擬毒死蜱分子理論拉曼光譜： 由Gaussview軟件構(gòu)建毒死蜱分子結(jié)構(gòu)， 使用Gauss03對(duì)毒死蜱分子進(jìn)行計(jì)算， 計(jì)算方法為B3LYP， 基組設(shè)置為6-31G， 最后由Gaussview分析計(jì)算結(jié)果， 得到毒死蜱分子理論拉曼光譜。

1.5 表面增強(qiáng)拉曼光譜采集

分別取500 μL金膠、 40 μL待測(cè)溶液、 100 μL 1%氯化鈉溶液加入到石英進(jìn)樣瓶中， 均勻混合， 采集拉曼信號(hào)。 采集參數(shù)為： 激發(fā)波長785 nm、 激光功率400 mW、 積分時(shí)間10 s、 積分次數(shù)2次、 分辨率4 cm-1。 每個(gè)樣本采集3次， 得到平均光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米溶膠表征及用量優(yōu)化

圖1是金溶膠紫外吸收光譜圖(a)和電鏡掃描圖(b)。 從圖可看出， 金溶膠最大吸收峰在540 nm， 該吸收峰呈單峰， 表明試驗(yàn)所制備的金納米粒子呈球形且粒徑均勻[15]。 由電鏡掃描結(jié)果圖可看出， 金納米粒子呈球形， 且粒徑約為55 nm， 分散效果良好。

圖1 金納米溶膠的UV-Vis圖(a)和SEM圖(b)

圖2是濃度為20 mg·L-1毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液、 氯化鈉溶液與不同體積的金納米溶膠混合后SERS譜圖， 從圖中可以看出， 隨著金納米溶膠用量的增多， 毒死蜱SERS信號(hào)逐漸增強(qiáng)。 當(dāng)體積比為2∶5∶25時(shí)， 毒死蜱拉曼信號(hào)最強(qiáng)。 毒死蜱分子與金納米溶膠的熱點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài)， 納米金的用量繼續(xù)增加時(shí)， 會(huì)促使納米金發(fā)生聚集現(xiàn)象從而導(dǎo)致毒死蜱SERS信號(hào)的降低。 因此， 采用毒死蜱、 氯化鈉、 金溶膠溶液體積分別為40， 100和500 μL。

圖2 20 mg·L-1毒死蜱、 氯化鈉與金納米溶膠不同體積表面增強(qiáng)拉曼

Fig.2 SERS of chlorpyrifos (20 mg·L-1) and sodium chloride solution with different volumes of gold colloid

a: 2∶5∶40；b: 2∶5∶25；c: 2∶5∶10；

d: 2∶5∶5；e: 4∶10∶5

2.2 茶葉中毒死蜱拉曼光譜特征峰的確定

2.2.1 毒死蜱農(nóng)藥理論計(jì)算與試驗(yàn)譜峰分析

圖3(a)是5 mg·L-1毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS， (b)是毒死蜱分子的理論計(jì)算拉曼光譜。 從圖可看出， 在462， 526， 560， 674， 760， 972， 1 096， 1 164和1 534 cm-1處試驗(yàn)譜峰與理論計(jì)算譜峰略有偏移。 在608， 1 266和1 566 cm-1處測(cè)得的譜峰理論譜峰中未出現(xiàn)。 這是因?yàn)槔碚撃M只考慮毒死蜱分子， 未考慮溶劑影響， 而在實(shí)際檢測(cè)過程中， 毒死蜱分子與溶劑分子之間存在相互作用， 導(dǎo)致增強(qiáng)基底對(duì)不同官能團(tuán)產(chǎn)生的增強(qiáng)效果差異較大， 從而出現(xiàn)有些試驗(yàn)譜峰與理論計(jì)算譜峰略有偏移， 有些新的譜峰在理論計(jì)算和試驗(yàn)中不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)。

2.2.2 茶葉中毒死蜱農(nóng)藥譜峰分析

圖4是濃度為5 mg·L-1毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)濃度為11.11 mg·kg-1含毒死蜱殘留綠茶提取液(b)乙腈(c)和陰性綠茶提取液(d)的SERS。 基于表1歸屬結(jié)果， 圖4a中462， 526， 560， 674， 760， 972， 1 096， 1 164和1 534 cm-1是毒死蜱農(nóng)藥分子的特征峰； 從圖4d可以看出， 陰性綠茶提取液SERS譜圖中的976， 1 162和1 534 cm-1與毒死蜱分子特征峰(972， 1 164和1 534 cm-1)相接近， 因此， 這3個(gè)特征譜峰不能用于綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的分析； 而對(duì)比圖3、 表1及圖4可知， 526， 560， 674， 760和1 096 cm-1與陰性綠茶提取液特征峰均不重疊。 由此526， 560， 674， 760和1 096 cm-1可用于綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的定性定量分析。

圖3 5 mg·L-1毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS(a)和毒死蜱理論拉曼光譜(b)

表1 毒死蜱的拉曼譜峰歸屬

Table 1 Raman vibrational frequencies assignments of chlorpyrifos

Theoreticalcalculation/cm-1SERS/cm-1Assignments450462δ(N-cyclopropyl)opp524526ν(P—O)570560ν(PS)+ν(CCl)-608ν(C—Cl)+ν(PS)668674νring752760ν(P—O—C)968972ν(P—O—C)1 0841 096δ(C—H)ip1 1501 164νring-1266δ(C—H)ip1 5321 534ν(C—N)-1 566ν(CC)

注：ν： 伸縮振動(dòng)； opp： 面外彎曲； δ： 變形振動(dòng)； ip： 表面內(nèi)彎曲

Note:ν: Stretching vibration; opp: Surface bedn;δ: Deformation vibration; ip: Interral bend

2.3 優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 NBC用量優(yōu)化結(jié)果分析

圖5是不同用量NBC對(duì)含毒死蜱農(nóng)殘綠茶提取液凈化效果圖(a)和SERS(b)。 由圖可看出， 隨著NBC用量增加， 綠茶提取液顏色由棕色逐漸變成無色， 說明NBC對(duì)色素有一定的吸附作用， 可消除色素的熒光效應(yīng)。 當(dāng)用量為15 mg時(shí)， 提取液仍有淡淡的顏色， 而未出現(xiàn)毒死蜱特征峰， 當(dāng)用量20 mg時(shí)， 得到無色透明溶液， 且出現(xiàn)毒死蜱特征峰526， 560， 674， 760和1 096 cm-1， 隨著用量增加， 毒死蜱特征峰沒有明顯變化。 由此可見， 采用20 mg NBC用量基本可消除色素的影響。

圖4 5 mg·L-1毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液a， 濃度為11.11 mg·kg-1以綠茶提取液為基質(zhì)的毒死蜱b、 乙腈c和陰性綠茶提取液d的SERS

Fig.4 SERS of 5 mgˉL-1chlorpyrifos standard solutiona, 11.11 mg·kg-1chlorpyrifos solution based on tea extractionbacetonitrilecand negative matrix of tea extractiond

圖5 不同用量NBC吸附后綠茶提取液凈化效果(a)和SERS(b)

Fig.5 Purification effect (a) and SERS (b) of tea extraction treated by different dosages of NBC

2.3.2 前處理方法的準(zhǔn)確性與精密度分析

采用20 mgNBC進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)， 添加水平分別為2.78， 6.11和9.44 mg·kg-1， 每個(gè)添加濃度采集3次， 結(jié)果如表2所示。 由表可知， 優(yōu)化的快速前處理方法檢測(cè)綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的平均回收率96.00%～99.79%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.77%～5.86%， 說明優(yōu)化的前處理方法精密度和可靠性好。

表2 優(yōu)化前處理方法的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 茶葉中毒死蜱農(nóng)藥殘留定性定量分析

圖6是含毒死蜱農(nóng)藥殘留的綠茶提取液SERS， 從圖可看出， 隨著毒死蜱濃度的降低， 其特征峰強(qiáng)度逐漸減弱， 濃度為6.67 mg·kg-1時(shí)， 特征峰760 cm-1已無法識(shí)別； 濃度為1.11 mg·kg-1時(shí)， 526， 674和560 cm-1無法識(shí)別， 特征峰1 096 cm-1仍清晰可見； 濃度為0.56 mg·kg-1時(shí)， 特征峰1 096 cm-1依然明顯， 而濃度為0.28 mg·kg-1時(shí)， 各特征峰均無法辨別， 說明本方法檢測(cè)綠茶中毒死蜱農(nóng)藥的最低檢出濃度約為0.56 mg·kg-1。

圖6 綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留SERS

a—k: 11.11， 10， 8.89， 7.78， 6.67， 5.56， 4.44， 3.33， 2.22， 1.11， 0.56， 0.28 mg·kg-1

由圖6可知， 特征峰1 096 cm-1峰型好， 且隨濃度變化明顯， 故選用1 096 cm-1處的峰強(qiáng)度與綠茶中毒死蜱濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖7是峰強(qiáng)為1 096 cm-1處峰強(qiáng)與濃度的相關(guān)曲線， 相關(guān)曲線y=0.017 5x+0.909 2， 決定系數(shù)為R2=0.986 3。 從圖可看出， 在濃度0.28～11.11 mg·kg-1范圍內(nèi)， 該處峰強(qiáng)度與綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留線性關(guān)系良好。

圖7 以綠茶提取液為基質(zhì)毒死蜱農(nóng)藥殘留分析曲線

Fig.7 Relation between the concentration of Chlorpyrifos in green tea extraction and the peak intensity of 1 096 cm-1

2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度分析

采用前述優(yōu)化前處理方法， 向陰性茶葉提取液中加入毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液， 配制2.78， 6.11和9.44 mg·kg-1濃度梯度待測(cè)液， 每個(gè)濃度測(cè)定3個(gè)平行樣本， 分析結(jié)果見表3。 由表可知， 方法的平均回收率在96.71%～105.24%之間， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.36%～3.65%， 說明本方法用于檢測(cè)綠茶中毒死蜱殘留是可行的。

表3 茶葉中毒死蜱的平均回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié) 論

研究綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)方法。 采用金溶膠為增強(qiáng)基底， 分析不同用量NBC填料對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響， 得出20 mg NBC能較好地去除綠茶提取液中的色素影響。 密度泛函理論計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較， 得到定性定量分析綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的5個(gè)特征峰。 以1 096 cm-1的峰強(qiáng)度建立綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留線性分析方程。 添加回收率實(shí)驗(yàn)表明， 該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。 此方法分析綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留的最低檢出濃度可達(dá)到0.56 mg·kg-1。 前處理簡單， 單個(gè)樣本檢測(cè)可在10 min內(nèi)完成， 為綠茶中農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)裝置開發(fā)提供方法支持。