三種梅毒螺旋體血清學(xué)檢驗(yàn)方法的臨床應(yīng)用分析

肖 霞，滕春燕，馬 慧，宋丹丹，李艷蕾,王 欣

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130041)

梅毒是一種由梅毒螺旋體感染人體產(chǎn)生的慢性傳染性疾病，主要通過(guò)粘膜接觸進(jìn)行傳播，也可母嬰垂直傳播。該病臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜。病程分為三期，一期、二期又稱(chēng)為早期梅毒，傳染性強(qiáng)破壞性小，三期梅毒又稱(chēng)為晚期梅毒，傳染性弱但是破壞性較強(qiáng)，未得到及時(shí)治療可造成人體多器官受累，多系統(tǒng)損害，功能失常，如心血管梅毒、骨梅毒和神經(jīng)梅毒等，甚至危及生命[1]。目前，由于核酸擴(kuò)增技術(shù)尚未廣泛應(yīng)用于臨床，故血清學(xué)檢測(cè)仍然是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)梅毒螺旋體感染最常用的方法[2]。人體感染梅毒螺旋體后產(chǎn)生兩種抗體[3]，一種針對(duì)梅毒螺旋體的特異性抗體，在梅毒感染約2周左右即可產(chǎn)生，此類(lèi)血清抗體檢測(cè)臨床通常使用梅毒螺旋體明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)(TPPA)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)檢測(cè)；另一種為針對(duì)類(lèi)脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的非特異性抗體，通常較特異性抗體出現(xiàn)晚2-3周，臨床可選用快速血漿反應(yīng)素環(huán)形卡片實(shí)驗(yàn)(RPR)、甲苯胺紅不加熱血清實(shí)驗(yàn)(TRUST)等方法進(jìn)行檢測(cè)[4]。本研究采用梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(TP-ELISA)、梅毒螺旋體明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)(TPPA)、快速血漿反應(yīng)素環(huán)形卡片實(shí)驗(yàn)(RPR)分別檢測(cè)梅毒患者血清，評(píng)價(jià)不同血清學(xué)檢驗(yàn)方法的檢測(cè)效能，具體操作如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料搜集2019年1月-2019年3月我院門(mén)診及住院的10273例患者標(biāo)本進(jìn)行梅毒抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(TP-ELISA)，患者就診于不同科室，所患基礎(chǔ)疾病不同，其中男性5169名，女性5104名，年齡分布0-97歲，陽(yáng)性結(jié)果再分別進(jìn)行TPPA,RPR檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。將其中經(jīng)臨床診斷為梅毒的238例患者作為研究組，臨床診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)WS273-2018》。其中男143例，女95例，年齡19-82歲，梅毒一期106例，二期59例，三期16例； 潛伏期57例。選取健康體檢者150例作為對(duì)照組，其中男83例，女67例，年齡17-85歲。所有檢測(cè)標(biāo)本均為空腹采集的靜脈血血清。

1.2 方法

1.2.1儀器和試劑 主要試劑選用珠海麗珠試劑股份有限公司ELISA試劑盒、日本富士瑞必歐株式會(huì)社梅毒螺旋體診斷試劑盒(明膠顆粒凝集法)、上?？迫A生物技術(shù)有限公司RPR試劑盒；儀器選用愛(ài)得康ELISA600全自動(dòng)酶免分析儀。

1.2.2檢驗(yàn)方法 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采靜脈血3 ml，離心分離血清(4 000 r/min，6 min)。嚴(yán)格按照相應(yīng)說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行操作，首先進(jìn)行TP-ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果S/CO≥1的標(biāo)本，再分別進(jìn)行TPPA、RPR檢測(cè)，具體方法如下：(1)ELISA法： 應(yīng)用艾德康全自動(dòng)酶免分析儀進(jìn)行操作，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定程序，反應(yīng)完成后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，吸光度OD>0.105即(S/CO值>1)判定為陽(yáng)性。(2)TPPA法：將100 μl血清稀釋液加至微孔板第1孔內(nèi)，其后3孔各加入25 μl。用微量移液器取樣品25 μl至第1孔中，混勻后吸出25 μl至第2孔，同樣方式稀釋至第4孔，在第4孔混勻后棄去25 μl。稀釋后第3孔、第4孔稀釋倍數(shù)分別為1∶20、1∶40，使用微量加樣器在第3孔中加入25 μl未致敏顆粒，第4孔中加入25 μl致敏顆粒，此時(shí)樣本最終稀釋倍數(shù)為1∶40、1∶80，混勻后室溫水平放置2 h后觀察結(jié)果。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：第4孔反應(yīng)產(chǎn)生環(huán)狀分散粒子判定為陽(yáng)性。(3)RPR法：血清進(jìn)行倍比稀釋至1∶2、1∶4、1∶8、1∶16實(shí)驗(yàn)卡標(biāo)號(hào)1-4；依次從圈4-1將稀釋后標(biāo)本涂布于整個(gè)圈內(nèi)；加入1滴抗原(約17 μl/滴)；將實(shí)驗(yàn)卡置于水平旋轉(zhuǎn)儀，100±2 r/min旋轉(zhuǎn)8分鐘；取出實(shí)驗(yàn)卡在亮光下肉眼觀察結(jié)果。若標(biāo)本出現(xiàn)黑色塊狀沉淀，即判定為陽(yáng)性，陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)報(bào)告其稀釋倍數(shù)，即為其滴度。三種方法檢測(cè)完畢，結(jié)合臨床表現(xiàn)，選取有明確診斷的標(biāo)本作為研究組，與對(duì)照組進(jìn)行比較，針對(duì)三種檢測(cè)方法的敏感性和特異性進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料采用(n，%)表示，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗(yàn)，設(shè)置檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 10273例患者標(biāo)本進(jìn)行梅毒抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(TP-ELISA)的一般情況10273例患者為我院門(mén)診及住院患者，就診于不同科室，所患基礎(chǔ)疾病不同，男性5169名，女性5104名，其中TP-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的患者共336例，男性171例，女性165例，陽(yáng)性率約3%，年齡分布見(jiàn)表1。

表1 TP-ELISA陽(yáng)性患者年齡分布

2.2 336例TP-ELISA陽(yáng)性，3例TP-ELISA弱陽(yáng)性共計(jì)339例患者的TPPA結(jié)果與TP-ELISA結(jié)果符合率隨TP-ELISA S/CO值的升高呈現(xiàn)同步升高趨勢(shì),見(jiàn)表2。

表2 TP-ELISA TPPA檢測(cè)結(jié)果的符合率

2.3 三種檢測(cè)方法敏感度、特異度分別統(tǒng)計(jì)238例梅毒患者與150例非梅毒患者的三種檢測(cè)方法結(jié)果得知，TPPA法敏感度與特異度分別為97.47%、99.33%；ELISA法分別為98.32%、98.00%；RPR法分別為78.57%、94.00%。見(jiàn)表3。

2.4 三種檢測(cè)方法在不同分期梅毒患者的陽(yáng)性檢出率對(duì)于一期、二期與潛伏期梅毒，RPR方法檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯低于TPPA、ELISA法(P<0.05)，而對(duì)于三期梅毒，三種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率未有明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三種梅毒螺旋體檢測(cè)方法敏感度和特異度

表4 不同分期梅毒患者的陽(yáng)性檢出率

3 討論

梅毒在我國(guó)傳染病防治法中被列為乙類(lèi)防治病種，近年來(lái)在我國(guó)患病率持續(xù)攀升，該病早期主要侵犯皮膚和粘膜，晚期還可侵犯心臟血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成重要器官及組織永久性損害[5]。梅毒病程較長(zhǎng)，早期防治控制病程進(jìn)展是治療關(guān)鍵，目前臨床上依據(jù)患者病史、血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果、臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合診斷，故提高實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)梅毒螺旋體的靈敏度，選擇合適的檢測(cè)方法，對(duì)于明確診斷、盡早治療梅毒具有重要意義。梅毒螺旋體感染人體，可產(chǎn)生梅毒螺旋體非特異性(抗類(lèi)脂質(zhì)抗體)與特異性?xún)煞N不同的抗體類(lèi)型，兩種抗體的檢測(cè)對(duì)于梅毒患者的篩檢及確認(rèn)具有不同的臨床意義，非特異性抗體又稱(chēng)為反應(yīng)素，在梅毒螺旋體感染3-4周產(chǎn)生，伴隨著有效治療而消失，后者為特異性抗體，在感染2周左右產(chǎn)生，這種IgG類(lèi)型抗體一旦產(chǎn)生，便會(huì)終身攜帶，不會(huì)隨著有效治療而消失。兩種抗體在疾病的診斷，療效觀察，復(fù)發(fā)判斷方面具有不同的意義。本研究中所選TPPA、ELISA檢測(cè)方法針對(duì)特異性抗體、RPR檢測(cè)方法則針對(duì)非特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)， 探討了三種檢測(cè)方法的符合率及臨床應(yīng)用價(jià)值。

本次研究對(duì)象為我院門(mén)診及住院患者共10273例，因?yàn)镋LISA方法操作簡(jiǎn)單，可作為高通量的檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行自動(dòng)化儀器操作，且敏感性較好，所以被作為首選的篩查方法。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)判讀后，共336例判斷陽(yáng)性，陽(yáng)性率約3%，其中由于參與檢測(cè)的患者年齡不同，所患基礎(chǔ)疾病不同，存在一定引起TP-ELISA法生物學(xué)假陽(yáng)性的因素。TPPA法檢測(cè)是采用梅毒螺旋體毒株作為抗原包被在凝膠顆粒上，與梅毒血清樣本中的特異性抗體結(jié)合產(chǎn)生顆粒凝集。是目前較權(quán)威的梅毒確診實(shí)驗(yàn)[6]方法，所以，我們將ELISA 檢測(cè)判斷陽(yáng)性的336份及處于檢測(cè)灰區(qū)(S/OD值0.9-1)的3份標(biāo)本共339份又進(jìn)行了TPPA法檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)ELISA與TPPA檢測(cè)陽(yáng)性符合率，發(fā)現(xiàn)兩者符合率隨TP-ELISA檢測(cè)S/OD值升高而升高，在TP-ELISA法測(cè)定值為 1-6 區(qū)間時(shí)，兩者符合率為僅為43.8%(39/89)。 因此對(duì)臨床用ELISA 法檢測(cè)到(S/CO)低值樣本時(shí)，用 TPPA 法開(kāi)展確證實(shí)驗(yàn)尤為必要，并應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)加以判斷，以減少因ELISA法假陽(yáng)性發(fā)生而引起的誤診。

336例TP-ELISA陽(yáng)性的患者中，經(jīng)臨床確診的梅毒患者為228例，我們又選取了150例非梅毒患者進(jìn)行TP-ELISA法,TPPA法,RPR法三種方法同時(shí)檢測(cè)，并對(duì)比三種方法的應(yīng)用價(jià)值。檢測(cè)結(jié)果顯示：在敏感性方面，檢測(cè)梅毒特異性抗體的TPPA法在一期梅毒及二期梅毒的檢測(cè)敏感性略低于TP-ELISA 法檢測(cè)，但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RPR法敏感性最低。RPR法檢測(cè)的為梅毒非特異性抗體，即類(lèi)脂質(zhì)類(lèi)抗體，其出現(xiàn)較特異性抗體晚，因此其在一期梅毒的敏感性要低于TPPA和TP-ELISA法，類(lèi)脂質(zhì)類(lèi)抗體會(huì)隨著梅毒有效治療而逐漸消失，這也是引起RPR 檢測(cè)的檢出率在各期梅毒均低于TPPA及TP-ELISA的原因之一；在特異性方面，TPPA法在三種檢測(cè)方法中特異性最高，RPR法特異性最低。盡管如此，TPPA法和TP-ELISA法仍存在約1%的假陽(yáng)性率，如老年患者、腫瘤患者、自身免疫性疾病患者、孕婦、長(zhǎng)期吸毒患者，及部分合并其他螺旋體感染的患者均會(huì)引起特異性抗體檢測(cè)的生物學(xué)假陽(yáng)性反應(yīng)，而且梅毒特異性抗體的陽(yáng)性結(jié)果無(wú)法區(qū)分患者處于是發(fā)病期還是繼往感染，因此不能夠單純依據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行診斷[7]梅毒，需結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行判斷，RPR法檢測(cè)的抗體不具有特異性，許多疾病如結(jié)核病、麻風(fēng)等在疾病過(guò)程中均產(chǎn)生類(lèi)似抗體，故RPR法假陽(yáng)性率較高。臨床上，該法常用于通過(guò)觀察滴度的變化來(lái)判斷梅毒療效或觀察病程[11]。

梅毒血清學(xué)檢驗(yàn)在臨床診斷中占據(jù)重要地位，TPPA、ELISA敏感度與特異度均較好，在各期梅毒診斷中均具有良好的穩(wěn)定性，是較為理想的血清學(xué)檢測(cè)方法。RPR法靈敏度和特異度雖略低于前兩者，但作為梅毒療效評(píng)價(jià)方法成本低，操作簡(jiǎn)單，被廣泛應(yīng)用。TPPA或ELISA法聯(lián)合RPR可作為梅毒篩查的可靠方法[12，13]，在提高陽(yáng)性檢出率同時(shí)減少假陰性率，并作為觀察梅毒療效及病程的重要指標(biāo)，指導(dǎo)患者得到及時(shí)有效的診治。對(duì)于梅毒檢出陽(yáng)性患者，臨床醫(yī)師還應(yīng)結(jié)合病史、癥狀、體征等綜合分析，以提高確診率[14]。