腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞趨化的影響

陳雨蒙 喬春燕 劉欣辰 孟 琳 任春霞 鄭夢丹 鄭適澤 孫宏晨

（1.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室 吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，3.牙體牙髓科，4.牙周科，吉林 長春 130021）

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是一種常見的惡性腫瘤，有局部浸潤率高、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的特點。目前該腫瘤的常規(guī)治療手段并沒有取得令人滿意的效果。長期以來，腫瘤被認(rèn)為是孤立的腫塊，在器官的特定部位獨立存在。近年來，人們逐漸認(rèn)識到腫瘤微環(huán)境 （tumor microenvironment,TME）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。TME是一個動態(tài)網(wǎng)絡(luò)，它包括腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和腫瘤間質(zhì)組織等，是影響腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。其中，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblast,CAF）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage,TAM）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）等都是TME的重要組成部分。這些細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和酶，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[1-2]。

TAM作為腫瘤微環(huán)境及免疫細(xì)胞的重要組成部分，已經(jīng)成為抗腫瘤研究中的關(guān)鍵靶點。作為浸潤在TME中最豐富的免疫細(xì)胞，TAM從早期癌變到腫瘤轉(zhuǎn)移的過程都發(fā)揮著重要作用。TAM在TME內(nèi)主要極化為2種類型：一種是經(jīng)典激活類型（M1型巨噬細(xì)胞），具有抑制腫瘤的作用；另一種是交替激活類型（M2型巨噬細(xì)胞），具有支持腫瘤侵襲和進(jìn)展的作用，且與多種癌癥的不良預(yù)后顯著相關(guān)。在腫瘤形成的初始階段，外周血中的單核細(xì)胞聚集到腫瘤周圍，主要極化為M1型巨噬細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤的免疫作用。然而，一旦腫瘤形成，在局部缺氧偏酸的TME條件下，巨噬細(xì)胞極化為M2型，具有促進(jìn)腫瘤生長、侵襲、血管生成以及抑制免疫應(yīng)答的作用[3-4]。本課題組已通過實驗證實，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在大量的M2型巨噬細(xì)胞[5]。因此，研究TAM募集和極化的機制有助于研究新的抗腫瘤療法，并改善HNSCC的治療效果。

近年來不斷有研究表明，VEC在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用[6-8]。VEC具有不規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)可形成穿過血管腔的細(xì)長突起,細(xì)胞邊緣皺縮導(dǎo)致細(xì)胞間連接喪失，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙使血管通透性增加，加之動、靜脈分布不均且排列混亂，同時有大量新生血管形成，為腫瘤提供生長所需的氧氣和營養(yǎng)。這些特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)均為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移提供了便利。然而，VEC作為單核細(xì)胞輸送至TME的重要路徑，是否對TAM的募集和極化產(chǎn)生影響，仍有待研究。

本研究以腫瘤誘導(dǎo)的VEC入手，觀察TME中VEC的形態(tài)變化，利用Transwell及RT-PCR等技術(shù)探討HNSCC中TAM的來源及極化的可能機制，從而為HNSCC的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞

HNSCC Cal-27細(xì)胞株由上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院陳萬濤教授饋贈，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,Huvecs）、 舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）細(xì)胞、人咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 （human pharyngeal squamous cell carcinoma，F(xiàn)adu）細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），THP-1人單核細(xì)胞系由中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所饋贈。

1.2 主要試劑與儀器

H-DMEM 培養(yǎng)基粉劑（Gibco公司,美國）、1640培養(yǎng)基粉劑（Gibco公司,美國）、ECM培養(yǎng)基（Sciencell公司，美國）、胎牛血清（BI公司，以色列）、青霉素-鏈霉素（Hyclone公司，美國）、磷酸鹽緩沖鹽粉劑（中杉金橋公司，中國）、胰蛋白酶粉劑（Sigma公司，美國）、PMA （Solarbio 公司，中國）、Hoechst染液（Sigma 公司,美國）、Transwell小室（Costar公司,美國）、Trizol試劑（Invitrogen 公司,美國）、Primer Script Treagent Kit試劑盒 （生工生物公司,中國）、SYBR remix Ex Taq試劑盒 （生工生物公司，中國）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

Cal-27、Fadu細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的HDMEM培養(yǎng)基 （含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，Huvecs培養(yǎng)于ECM培養(yǎng)基，THP-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基 （含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，將其置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞每3 d傳代，THP-1懸浮細(xì)胞每2～4 d換液，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4 收集條件培養(yǎng)基

Cal-27、Fadu細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；收集培養(yǎng)基，0.22 μm濾器濾過細(xì)胞碎片，-70℃保存?zhèn)溆?此即條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）。

1.5 顯微鏡觀察形態(tài)

取對數(shù)生長期的Huvecs細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，分別使用ECM培養(yǎng)基和Cal27條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.6 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移情況

采用5 μm微孔聚碳酸酯膜Transwell小室，將Hoechst染液預(yù)處理30 min的THP-1細(xì)胞以每孔1×105個接種于上室，在下室分別加入600 μL正常血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基或Cal27誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，避光培養(yǎng)6 h后，取出上室，在熒光顯微鏡下觀察。隨機選取3個視野計數(shù)細(xì)胞并拍照,計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 實時定量RT-qPCR

用HNSCC的條件培養(yǎng)基將VEC誘導(dǎo)為腫瘤相關(guān)VEC。將THP-1細(xì)胞分為3組，使用PMA誘導(dǎo)THP-1貼壁為巨噬細(xì)胞，分別與正常內(nèi)皮細(xì)胞、Cal27相關(guān) VEC、Fadu相關(guān) VEC共培養(yǎng) 72 h。按Trizol說明書步驟分別提取每組細(xì)胞的總RNA,使用Primer Script Treagent Kit試劑盒將提取的純度和完整性良好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再以cDNA為模板，使用SYBR remix Ex Taq試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。以β-actin為內(nèi)參,檢測白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、 腫瘤壞死因子 α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、 精氨酸酶 1（arginase 1，Arg-1）、集落刺激因子（colony stimulating factor ，CSF）、趨化因子 2（chemokine ligand 2，CCL2）、趨化因子 5（chemokine ligand 5，CCL5）、趨化因子 8（chemokine ligand 8，CCL8）、趨化因子 12（chemokine ligand 12，CXCL12）、 趨 化 因 子 16（chemokine ligand 16，CXCL16）的表達(dá),引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差（One Way ANOVA）分析，各組間比較采用Tukey法及LSD法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01及P＜0.001表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤誘導(dǎo)VEC形態(tài)變化

如圖1A所示，顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，正常VEC呈梭形，細(xì)胞形態(tài)清晰，排列整齊，呈單層鋪路石狀，細(xì)胞長滿時呈漩渦狀或魚群狀。如圖1B所示，用Cal27誘導(dǎo)24 h后的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)伸長，變?yōu)槎嘟切危?xì)胞間連接疏松，排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多。

2.2 單核細(xì)胞趨化實驗

用HNSCC的條件培養(yǎng)基將VEC誘導(dǎo)為腫瘤相關(guān)VEC，使用Hoechst染液預(yù)處理單核細(xì)胞THP-1，分別使用正常內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基，Cal27及Fadu相關(guān)VEC條件培養(yǎng)基趨化單核細(xì)胞。Transwell實驗結(jié)果表明，與正常內(nèi)皮細(xì)胞相比，Cal27相關(guān)VEC趨化單核細(xì)胞能力顯著增強 （P＜0.001），F(xiàn)adu相關(guān)VEC趨化單核細(xì)胞能力也增強（P＜0.05）。詳見圖2。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

圖1 VEC的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（×20）Figure 1 Morphology of vascular endothelial cells（×20）

圖2 VEC胞經(jīng)不同細(xì)胞誘導(dǎo)后的Tanswell實驗（×4）Figure 2 Transwell experiment of vascular endothelial cells induced by different tumor cells（×4）

2.3 VEC分泌單核細(xì)胞趨化因子

分別使用Cal27和Fadu誘導(dǎo)VEC 24 h，通過RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，與正常VEC相比，腫瘤誘導(dǎo)后的VEC分泌多種單核細(xì)胞趨化因子的能力增強。如圖 3所示，Cal27相關(guān) VEC分泌 CCL2、CXCL16、CSF 增多 （P＜0.05），CCL8 的表達(dá)明顯升高 （P＜0.01），CCL5 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）。 Fadu 相關(guān)VEC 分泌的 CCL2、CCL12 增多 （P＜0.05），CCL5、CCL16、CSF 的表達(dá)明顯上調(diào) （P＜0.01），CCL8 的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。

圖3 RT-qPCR檢測單核細(xì)胞趨化因子Figure 3 Detection of monocyte chemokines by RT-qPCR

2.4 腫瘤誘導(dǎo)后的VEC影響巨噬細(xì)胞極化表型

用PMA將單核細(xì)胞THP-1誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，分別用正常VEC、Cal27相關(guān)VEC、Fadu相關(guān) VEC與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，72 h后檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，與正常內(nèi)皮細(xì)胞組對照，實驗組發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因TNF-α、IL-6和IL-1β無明顯變化，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因IL-10及Arg-1的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。

圖4 RT-qPCR檢測巨噬細(xì)胞極化表型Figure 4 Detection of macrophage polarization phenotype by RT-qPCR

3 討論

如圖5所示，本實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導(dǎo)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞質(zhì)形成較長的突起，細(xì)胞皺縮使細(xì)胞間連接疏松；RT-qPCR發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌大量單核細(xì)胞趨化因子，將循環(huán)系統(tǒng)的單核細(xì)胞募集至TME，并進(jìn)一步通過分泌某種細(xì)胞因子將巨噬細(xì)胞極化為IL-10、Arg-1高表達(dá)的M2型巨噬細(xì)胞，而M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物 IL-6、TNF-α、IL-1β 變化不明顯。

圖5 實驗?zāi)Ｊ綀DFigure 5 Experimental model diagram

目前研究發(fā)現(xiàn)，TAM具有促進(jìn)腫瘤生長、侵襲、血管生成以及抑制免疫應(yīng)答的作用，故TAM的來源引起人們的密切關(guān)注?，F(xiàn)TAM通常被認(rèn)為來源于外周血單核細(xì)胞，被基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)的多種趨化因子和細(xì)胞因子招募至TME中，如單核 細(xì) 胞 趨 化 因 子 CCL2、CCL3、CCL5、CCL8、CXCL12、CXCL16和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）等。 進(jìn)一步，募集而來的單核-巨噬細(xì)胞在TME中可能被極化為M1型和M2型。研究發(fā)現(xiàn)，在大部分腫瘤內(nèi)，單核細(xì)胞受Toll樣受體相關(guān)配體和γ-干擾素（interferon-γ,IFN-γ） 激活可極化為 M1 型 TAM，促炎細(xì)胞因子表達(dá)明顯升高，如IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等，可以在一定程度上抑制腫瘤的生長；TME 內(nèi)的多種細(xì)胞因子如 IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-21和IL-33，可將單核細(xì)胞極化為M2型TAM，并分泌大量與組織重塑相關(guān)的因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases,MMPs）家族的MMP-2和MMP-9等，促進(jìn)腫瘤生長[9-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)VEC使巨噬細(xì)胞IL-10、Arg-1高表達(dá)。已有研究表明M2型巨噬細(xì)胞通過高表達(dá)Arg-1，將精氨酸水解為鳥氨酸和尿素，而L-精氨酸衍生的代謝產(chǎn)物、半胱氨酸和色氨酸是髓系來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）發(fā)揮免疫抑制作用的重要介質(zhì)[12]。此外，TAM通過消耗Arg-1在一定程度上抑制了T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展[13]。Colegio等[14]在多種小鼠腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，TAM通過缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）介導(dǎo)的缺氧或經(jīng)乳酸途徑誘導(dǎo)Arg-1表達(dá)升高，Arg-1的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的生長，而抑制Arg-1則可以抑制腫瘤生長[15]。IL-10是TME中重要的免疫抑制因子，與腫瘤進(jìn)展及治療中的免疫耐受密切相關(guān)[16]。且有研究表明，在HNSCC中，IL-10通過促進(jìn)T細(xì)胞凋亡和抑制機體免疫系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[17]。

現(xiàn)階段已有大量以TAM為靶點進(jìn)行抗腫瘤免疫治療的研究[18]，主要分為以下幾個方面：抑制巨噬細(xì)胞募集進(jìn)入腫瘤；抑制TAM的生存；將TAM轉(zhuǎn)化為抗腫瘤M1表型，并阻斷M2型TAM的極化。例如曲貝替定（trabectedin）是靶向單核細(xì)胞趨化因子CCL2的一種新型抗腫瘤藥物。各種實驗研究表明，trabectedin可以減少腫瘤組織中單核細(xì)胞的募集及其向TAM分化，目前它在治療人體乳腺癌和其他實體惡性腫瘤的臨床應(yīng)用中取得了良好的效果[19]。有文獻(xiàn)報道，使用M-CSF受體抑制劑可極大減少腫瘤中TAM的數(shù)量，并抑制腫瘤的進(jìn)展、血管生成和轉(zhuǎn)移[20]。血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）能特異性地將血紅素代謝為一氧化碳（CO）、膽綠素和亞鐵離子，在抗炎、組織保護(hù)和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在小鼠乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制HO-1可使M2型TAM向M1型TAM極化，從而抑制腫瘤生長[21]。除此之外，已有研究報道二甲雙胍作為一種廣為人知治療糖尿病的藥物，在體內(nèi)可誘導(dǎo)M1型TAM重編程并抑制M2型TAM極化，且在不同癌癥模型中發(fā)揮積極作用[22-23]。而其在HNSCC的治療方面，鮮少報道。

盡管研究表明癌細(xì)胞衍生的趨化因子可促進(jìn)TAM的募集和極化[24]，但VEC作為TME中重要的細(xì)胞群體，在TAM積累中的作用及在HNSCC的確切來源，仍未被完全了解。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HNSCC的VEC分泌的多種趨化因子能募集并極化單核細(xì)胞。因此靶向這些趨化因子可能抑制HNSCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究證實了在HNSCC中，VEC將單核細(xì)胞趨化至TME，并將其極化為IL-10、Arg-1高表達(dá)的M2型TAM，提出了一種HNSCC中TAM的來源和極化的可能機制，為HNSCC的免疫治療提供理論依據(jù)。