利用廢革屑制備不同分子量肽-Zn螯合物的工藝探究

王明英 ，葛淑華 ，袁艷 ，刁 ★，王全杰 ,，段寶榮 ，王雪 ，欒俊

（1.煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東煙臺(tái)2 6 4 0 0 5；2.國(guó)家制革技術(shù)研究推廣中心，山東煙臺(tái)2 6 4 0 0 5）

我國(guó)是世界第一制革大國(guó)，每年皮革產(chǎn)量約6億平方米，約占世界的四分之一。制革業(yè)作為我國(guó)輕工業(yè)中的支柱產(chǎn)業(yè)，每年在為我國(guó)社會(huì)發(fā)展帶來(lái)利益的同時(shí)也產(chǎn)生大量的廢水、廢氣和固體廢棄物，并對(duì)環(huán)境及生態(tài)平衡帶來(lái)巨大的壓力，制革廢棄物的產(chǎn)生和無(wú)法處理或者處理不當(dāng)已經(jīng)嚴(yán)重阻礙制革行業(yè)發(fā)展[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)原料皮利用率只有約35%，剩下大部分以制革廢棄物的形式被丟棄。這些固體廢棄物中除了有少量的毛發(fā)、肉渣等非膠原蛋白以外，大部分是原皮修邊角料、灰皮片削皮屑等不含鉻膠原和藍(lán)革削勻、修邊等產(chǎn)生的含鉻膠原廢棄物，造成極大的資源浪費(fèi)[2-4]。據(jù)報(bào)道，印度每年產(chǎn)生15萬(wàn)噸的制革固體廢棄物；美國(guó)每年產(chǎn)生的制革廢棄物就達(dá)30萬(wàn)噸（只限含鉻廢棄物）；而我國(guó)每年產(chǎn)生的皮革固體廢棄物就達(dá)140多萬(wàn)噸[5]。面對(duì)如此嚴(yán)峻的環(huán)境壓力，提高固體廢棄物的利用，使之向高值化方向發(fā)展，避免利用中的二次污染已經(jīng)成為該領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

微量元素多肽螯合物的最早研究始于60年代。70年代后期，首次由美國(guó)Albion實(shí)驗(yàn)室，以動(dòng)植物蛋白和鐵元素為原料合成了蛋白鐵的螯合物，由此開(kāi)始了蛋白或多肽螯合物的研究與開(kāi)發(fā)[6-8]。對(duì)于微量元素多肽螯合物的研究，國(guó)內(nèi)直到上世紀(jì)90年代初期才開(kāi)始有了對(duì)它的研究。鋅是幾種植物生理過(guò)程中植物和花序的必需營(yíng)養(yǎng)元素，即光合作用，呼吸作用，蛋白質(zhì)、DNA、RNA和植物激素的合成[9]。缺鋅是全球植物最常見(jiàn)的微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏癥之一[10]。

化學(xué)肥料通常用于增加土壤中的鋅可利用性，并在營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)中保持該元素對(duì)植物的理想濃度[9]。農(nóng)業(yè)土壤中使用的鋅的來(lái)源是無(wú)機(jī)鋅肥料、合成和天然有機(jī)螯合物[11]。無(wú)機(jī)鋅肥源在鋅質(zhì)土壤中的效率相對(duì)較低，因?yàn)槟承┺r(nóng)藝限制，即沉淀為不溶性固體及其高雜質(zhì)[12]。合成螯合物可以有效解決缺鋅的問(wèn)題，但價(jià)格昂貴。合成螯合物載體的低降解性也是一個(gè)環(huán)境問(wèn)題[13]。P.Mohammadi[14]等人合成三種鋅氨基酸螯合肥，并應(yīng)用在萵苣中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋅營(yíng)養(yǎng)可以部分緩解鹽堿對(duì)萵苣根生長(zhǎng)引起的損害。劉音[15]發(fā)現(xiàn)氨基酸螯合肥在促進(jìn)芹菜和小白菜的生長(zhǎng)發(fā)育、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)方面具有顯著作用。張西興[16]等人以谷氨酸和硫酸鋅為原料制備出的螯合鋅肥料，螯合率可以達(dá)80%以上，在定性條件下再次證明了螯合的穩(wěn)定性。邢穎[17]等人利用乙二胺四乙酸與鋅鹽進(jìn)行螯合制備出乙二胺四乙酸鋅銨，作為一種補(bǔ)充鋅元素的螯合肥料。Zhang[18]等人研究醇糖螯合硫酸鋅，施用在富士蘋果樹(shù)上。研究將螯合鋅肥施用可以明顯降低果實(shí)膨大期蔗糖含量，增加果實(shí)成熟期蔗糖含量；顯著提高了果實(shí)膨大期和成熟期的果糖含量和葡萄糖；使幼果期和膨大期山梨醇含量顯著降低。

鋅對(duì)植物生長(zhǎng)有著不可忽視的作用，本文主要利用革屑制備多肽-Zn螯合物作為植物生長(zhǎng)的肥料，既實(shí)現(xiàn)廢棄革屑的回收利用，又解決了廢棄革屑的污染問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了其資源化利用，合成的多肽-Zn螯合物有機(jī)肥料可用于農(nóng)業(yè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

革屑：河北辛集東明皮革廠；鄰苯二甲醛：上海源葉生物科技有限公司，分析純；其他化學(xué)試劑均為分析純。

JH-752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限責(zé)任公司；SPD-50型自動(dòng)定氮儀：上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司；Nicolet 80 FTIR型傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SYP-D型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；DHG 101-00B型恒溫恒濕箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TYPE SPT12型消解儀：上海儀真分析儀器有限公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任有限公司；JJ224BC型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；Viscotek TDA305max多檢測(cè)器凝膠滲透色譜：英國(guó)Malvern儀器有限公司；AA-6880型石墨爐原子吸收光譜儀，島津企業(yè)管理有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同分子量多肽的制備

稱取50 g革屑于500 mL的三口燒瓶中。液比為5∶1，NaOH用量分別為8%、15%、20%。反應(yīng)溫度分別為 8℃、100℃、80℃（內(nèi)溫），反應(yīng)時(shí)間 6 h、8 h、10 h，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)水解液進(jìn)行離心、抽濾處理得到三種不同分子量多肽，并利用GPC測(cè)定其分子量。

1.2.2 多肽螯合Z n的制備

本探究中，利用堿水解多肽與Zn(CH3COO)2進(jìn)行螯合反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)流程如圖1。

對(duì)所得到的水解液進(jìn)行濃縮，使其固含量在30%左右。在所得到的濃縮液中加入Zn(CH3COO)2，在一定溫度、pH和時(shí)間下將多肽-Zn螯合。用有機(jī)溶劑無(wú)水乙醇對(duì)螯合液進(jìn)行沉淀處理，并進(jìn)行多次沖洗以除盡Zn離子。將所得沉淀進(jìn)行烘干處理，并研磨成粉末。

1.2.3 螯合率測(cè)定方法

將上述多肽-Zn螯合物用標(biāo)定后的EDTA進(jìn)行滴定，測(cè)定螯合鋅離子含量，進(jìn)而求取螯合率。采用標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.02 mol/L EDTA溶液進(jìn)行滴定，按如下公式計(jì)算螯合率：

式中：C0——EDTA濃度(mol/L)；

V0——消耗EDTA的體積(mL)；

M乙酸鋅——Zn(CH3COO)2的摩爾質(zhì)量；

m——獲得螯合物總質(zhì)量(g)；

m樣品——用于滴定的樣品質(zhì)量；

m乙酸鋅——加入的無(wú)水Zn(CH3COO)2的質(zhì)量(g)。

這種方法的前提是水解液中除了多肽和多肽-Zn螯合物外，幾乎沒(méi)有可溶性固體物質(zhì)。

a.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取一定量鉻標(biāo)液準(zhǔn)確配制濃度梯度為0、0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別將各濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液放入石墨爐原子吸收光譜儀(AAS)的樣品管內(nèi)，測(cè)定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

b.樣品的制備及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取絕干螯合鋅0.1 g（精確到0.0001 g），置于干燥潔凈的硬質(zhì)消化管中，向其中準(zhǔn)確加入5mL濃硫酸，輕輕搖勻，管口放置彎頸小漏斗。將硬質(zhì)消化管放入石墨消解爐中，保持消解爐溫度為250℃，加熱10min后取下，冷卻片刻后向其中逐滴加入2mL H2O2，將其搖勻后放回消解爐中繼續(xù)保持250℃加熱10 min，取下消化管稍冷后再次滴加2 mL H2O2，重復(fù)此操作3～4次，待消化管中樣品顏色變清亮后，繼續(xù)加熱10 min，使管內(nèi)過(guò)量的H2O2分解除去。取出消化管，待管內(nèi)液體冷卻后完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，用超純水定容，然后取1 mL溶液分兩次稀釋10000倍，配制成待測(cè)液。將待測(cè)液放入原子吸收分光光度計(jì)的樣品管內(nèi)，測(cè)定其吸光度，計(jì)算鉻濃度[20,21]。

1.2.5 G P C法測(cè)定多肽水解液分子量

1.2.5.1 溶劑和樣品準(zhǔn)備

溶劑選擇超純水。溶劑處理：采用溶劑過(guò)濾系統(tǒng)（真空過(guò)濾）對(duì)色譜純?nèi)軇┻M(jìn)行過(guò)濾和脫氣處理；樣品配制：取一定量樣品，用超純水溶解，攪拌過(guò)夜。樣品過(guò)濾：樣品溶解之后，采用一次微孔濾膜（孔徑0.22μm）對(duì)樣品溶液進(jìn)行過(guò)濾，保存濾液待用。

綜上所述，在對(duì)PHC患者進(jìn)行AFP、CA125、TK1聯(lián)合診斷后靈敏度與準(zhǔn)確率明顯高于單獨(dú)診斷，三者能夠起到互補(bǔ)作用，因此聯(lián)合診斷具有較高的臨床價(jià)值，有利于早期發(fā)現(xiàn)PHC，為臨床治療PHC奠定一定基礎(chǔ)。

1.2.5.2 分子量測(cè)定

色譜條件：色譜柱AGuard+1 x A6000M；流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3溶液，pH 6.0；流速 0.7 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量100μL。將所述的多肽水解液用流動(dòng)相配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，進(jìn)樣量為100μL，測(cè)定其分子量。

圖1 多肽-Zn螯合工藝流程圖Fig.1 Polypeptide-Zn chelation process flow chart

2 多肽-Z n螯合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 pH值的影響

在上述所得三種不同分子量的濃縮液中加入Zn(CH3COO)2，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間在60 min，多肽 -Zn質(zhì)量比為 5∶1，pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在此條件下進(jìn)行多肽-Zn螯合反應(yīng)。用無(wú)水乙醇對(duì)螯合液進(jìn)行沉淀，并進(jìn)行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進(jìn)行烘干處理，并研磨成粉末。

2.2 多肽-Zn比的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)確定最佳pH，在最佳pH條件下，在上述所得三種不同分子量濃縮液中加入Zn(CH3COO)2，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間在60 mim，多肽 -Zn 比分別為 3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，在此條件下進(jìn)行多肽-Zn螯合反應(yīng)。用無(wú)水乙醇對(duì)螯合液進(jìn)行沉淀，并進(jìn)行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進(jìn)行烘干處理，并研磨成粉末。

2.3 反應(yīng)溫度的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)確定最佳多肽-Zn比，在最佳pH與多肽-Zn比條件下，在上述所得三種不同分子量濃縮液中加入Zn(CH3COO)2，反應(yīng)時(shí)間在60 mim，反應(yīng)溫度分別為 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，在此條件下進(jìn)行肽Zn螯合反應(yīng)。用無(wú)水乙醇對(duì)螯合液進(jìn)行沉淀，并進(jìn)行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進(jìn)行烘干處理，并研磨成粉末。

2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)確定最佳反應(yīng)溫度，在最佳pH、多肽-Zn比與反應(yīng)溫度條件下，在上述所得三種不同分子量濃縮液中加入Zn(CH3COO)2，反應(yīng)時(shí)間分別在 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，在此條件下進(jìn)行多肽-Zn螯合反應(yīng)。用無(wú)水乙醇對(duì)螯合液進(jìn)行沉淀，并進(jìn)行多次沖洗以除盡游離的鋅離子。將所得沉淀進(jìn)行烘干處理，并研磨成粉末。

2.5 無(wú)水乙醇用量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

因?yàn)槎嚯?Zn-螯合物是一種水溶性的螯合物，我們選擇用無(wú)水乙醇對(duì)其進(jìn)行沉淀。其中無(wú)水乙醇的用量會(huì)影響螯合物的得率。無(wú)水乙醇的量過(guò)少的話，水就會(huì)稀釋無(wú)水乙醇，會(huì)有一部分多肽-Zn被水和無(wú)水乙醇的混合相溶解，這樣就會(huì)使多肽-Zn螯合物的得率降低。若無(wú)水乙醇過(guò)量的話，就會(huì)造成無(wú)水乙醇的浪費(fèi)，故要找到合適無(wú)水乙醇用量。將上述任一條件下的多肽-Zn螯合液分成10組，每組20 mL，無(wú)水乙醇與螯合物的比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1，無(wú)水乙醇的用量分別對(duì)應(yīng)為 40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 mL。計(jì)算每組下的多肽-Zn螯合物的得率。

2.6 多肽-Zn紅外光譜表征

將復(fù)合多肽水解液烘干、研磨成粉末，與溴化鉀混合壓片進(jìn)行傅里葉紅外光譜（FTIR）測(cè)試，利用PerkinElmer傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試，掃描范圍是 500 cm-1～ 4000 cm-1，分辨率為 0.5 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 鉻含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 鉻含量與吸光度關(guān)系曲線Fig.2 Chromium content and absorbance curve

由圖2可以看出，鉻含量與吸光度呈較好的線性關(guān)系，鉻含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.028x+0.00123，相關(guān)系數(shù) R2=0.99916。

結(jié)果顯示螯合鋅中的鉻含量為

3.2 水解液分子量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)水解度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用三種不同NaOH用量，即8%、15%、20%條件進(jìn)行革屑水解實(shí)驗(yàn)，為下一步螯合實(shí)驗(yàn)積累原料。本實(shí)驗(yàn)采用GPC準(zhǔn)確測(cè)定三種不同條件下NaOH水解革屑得到的多肽分子量，結(jié)果如表1所示。

表1 革屑水解液分子量分析Tab.1 The analysis of the molecular weight of leather hydrolyzed crumbs

從表1中可以看出，隨著NaOH用量的不斷增加，分子量呈減小趨勢(shì)。分子量分布較小，說(shuō)明每種條件下所獲得的多肽分子量相差較小。三種水解條件下分子量相差較大，有利于螯合實(shí)驗(yàn)的探究。

3.3 螯合物的評(píng)價(jià)結(jié)果

3.3.1 無(wú)水乙醇用量對(duì)螯合物得率的影響

由圖3可以看出，無(wú)水乙醇的用量較少時(shí)多肽-Zn螯合物的得率比較低，隨著無(wú)水乙醇用量的增多，乙醇沉淀螯合物的得率也在上升。當(dāng)無(wú)水乙醇的用量達(dá)到一定，即無(wú)水乙醇和螯合液的體積比為8∶1時(shí)，再增加無(wú)水乙醇的用量螯合物的得率不會(huì)再上升。此時(shí)既能使螯合物的產(chǎn)率達(dá)到最大，也不會(huì)造成資源的浪費(fèi)。

3.3.2 p H對(duì)螯合反應(yīng)的影響

反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，多肽-Zn比5∶1。pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖4所示。

圖3 無(wú)水乙醇的用量對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of the amount of anhydrous ethanol on the yield

由圖4可以看出，反應(yīng)體系pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響較大。在本反應(yīng)體系中，當(dāng)pH值為從5到8時(shí)，螯合反應(yīng)的螯合率隨著pH值的增加而增加；多肽1與多肽2在pH值為8時(shí)，多肽3在pH值為7時(shí)螯合率達(dá)到最大值；當(dāng)pH值大于8之后，螯合反應(yīng)的螯合率隨著pH值的增加反而迅速減小，并且多肽的分子量越小，螯合率就越大，這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH，增加了與Zn2+接觸的機(jī)會(huì)，從而使螯合率增加。

在本反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系堿性太弱，反應(yīng)體系中H+濃度增加，游離氨基會(huì)呈現(xiàn)質(zhì)子化狀態(tài)，阻礙與Zn2+結(jié)合，不利于螯合反應(yīng)的順利進(jìn)行；若反應(yīng)堿性太強(qiáng)，體系中的Zn2+容易與OH-反應(yīng)生成Zn(OH)2沉淀，消耗掉體系中的Zn2+，使Zn2+與—NH2與—COOH結(jié)合機(jī)會(huì)降低，從而使反應(yīng)的螯合率降低的同時(shí)也會(huì)使產(chǎn)品純度降低。因此應(yīng)利用鹽酸對(duì)螯合體系進(jìn)行中和，以保證反應(yīng)體系pH值始終維持在適宜的中等堿性范圍內(nèi)，不同分子量多肽與鋅進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)的螯合率在pH為7或8時(shí)達(dá)到最佳值，分子量從大到小螯合率依次為65.04%、67.36%、72.49%，根據(jù)反應(yīng)的多肽分子量的不同，反應(yīng)pH應(yīng)選擇7或8。

3.3.3 肽-Z n比對(duì)螯合反應(yīng)的影響

反應(yīng)條件為：pH為7或者8，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間60 min。肽-Zn比對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖5所示。

圖4 pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH on the chelation reaction

由圖5可以分析出，反應(yīng)的螯合率隨著乙酸鋅用量的減少而增加，當(dāng)減少到一定的量時(shí)，有減小的趨勢(shì)。當(dāng)多肽與Zn(CH3COO)2的質(zhì)量比值為3∶1時(shí)，不同分子量的多肽表現(xiàn)出反應(yīng)的螯合率較低，說(shuō)明此時(shí)的Zn離子過(guò)量，大量的Zn離子未參與螯合；當(dāng)提高二者比值，Zn的螯合率快速上升，多肽1與多肽2的多肽在肽鋅比達(dá)到7∶1時(shí)，多肽3的多肽在肽鋅比達(dá)到6∶1時(shí)，螯合率達(dá)到最大值，反應(yīng)的螯合率達(dá)到最大值，此時(shí)再增大肽鋅比，螯合率不再上升，說(shuō)明此時(shí)多肽的添加量已經(jīng)飽和，繼續(xù)添加對(duì)螯合率影響不大，而且可以明顯地看到，多肽的分子量越小，螯合率就越高，這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH，增加了與Zn2+接觸的機(jī)會(huì)，從而使螯合率增加，分子量從大到小螯合率依次為66.83%、75.33%、82.56%，根據(jù)反應(yīng)的多肽分子量的不同，反應(yīng)肽鋅比應(yīng)選擇6∶1或者7∶1。

3.3.4 溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響

反應(yīng)條件為：pH為7或者8，多肽-Zn的質(zhì)量比為6∶1或者7∶1，反應(yīng)時(shí)間60 min。溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖6所示。

圖5 多肽-Zn比對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of polypeptide Zn ratio on chelation

由圖6可以看出，在30～60℃螯合反應(yīng)的螯合率隨溫度的增加而增加，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)多肽1螯合率達(dá)到最大值，50℃時(shí)多肽2與多肽3螯合率均達(dá)到最大值。溫度可以影響螯合反應(yīng)的反應(yīng)速率與平衡常數(shù)，螯合反應(yīng)在低溫時(shí)，反應(yīng)速度較慢，螯合率較低，當(dāng)溫度升高時(shí)，加快螯合反應(yīng)的速度，螯合率提高。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)奶岣叻磻?yīng)溫度有利于增加多肽與Zn離子碰撞的次數(shù)，使螯合反應(yīng)順利進(jìn)行。然而，溫度過(guò)高時(shí)，多肽易發(fā)生羰氨反應(yīng)[22]，減少了Zn離子的螯合位點(diǎn)，而且氨基酸或小肽與金屬離子的螯合為放熱反應(yīng)[23]，過(guò)高的溫度反而不利于螯合。適宜的溫度范圍是50～70℃。從化學(xué)反應(yīng)平衡常數(shù)來(lái)考慮，溫度過(guò)高，逆反應(yīng)速率大于正反應(yīng)速率，化學(xué)平衡向逆方向移動(dòng)，因此得率與螯合率會(huì)下降。同時(shí)溫度升高會(huì)加快Zn離子的副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)率降低，因此螯合溫度不宜過(guò)高或過(guò)低，而且可以明顯地看到，多肽的分子量越小，螯合率就越高，這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH，增加了與Zn2+接觸的機(jī)會(huì)，從而使螯合率增加，分子量從大到小螯合率依次為57.93%、74.35%、76.23%，根據(jù)反應(yīng)的多肽分子量的不同，反應(yīng)溫度應(yīng)選擇50℃或者60℃。

3.3.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響

反應(yīng)條件為：pH為7或者8，多肽-Zn的質(zhì)量比為6∶1或者7∶1，反應(yīng)溫度50℃或者60℃。反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響如圖7所示。

由圖7可得，反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的螯合率影響較大，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)的螯合率隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，當(dāng)螯合率達(dá)到最大值時(shí)，再增加反應(yīng)的時(shí)間，反應(yīng)螯合率趨于平衡。反應(yīng)時(shí)間在60 min的時(shí)候，螯合率達(dá)到最大值。而且可以明顯地看到，多肽的分子量越小，螯合率就越高，這是由于小分子量的多肽能在溶液中暴露出更多的—NH2與—COOH，增加了與Zn2+接觸的機(jī)會(huì)，從而使螯合率增加，分子量從大到小螯合率依次為60.02%、69.23%、72.21%，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇60 min。

圖6 溫度對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the chelation reaction

3.4 多肽和多肽-Z n螯合物紅外光譜表征分析

采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)不同NaOH用量水解廢革屑多肽及多肽-Zn螯合物進(jìn)行表征分析，分析結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示。

當(dāng)金屬離子與包括O、N和S在內(nèi)的配體原子結(jié)合時(shí)，由于配位鍵的振動(dòng)，紅外光譜中的吸收峰典型地改變。因此，可以表明Zn與肽的有機(jī)基團(tuán)的相互作用。三種分子量多肽和多肽-Zn螯合物的FTIR光譜顯示在圖8、圖9與圖10中。圖8中，在3428.20 cm-1處的高頻吸收指的是多肽中N—H的伸縮振動(dòng)，并且螯合反應(yīng)導(dǎo)致更低的波數(shù)3403.51 cm-1，圖9中，在3342.64 cm-1處的高頻吸收指的是多肽中N—H的伸縮振動(dòng)，并且螯合反應(yīng)導(dǎo)致更低的波數(shù)3335.90 cm-1，圖10中，在3342.19 cm-1處的高頻吸收指的是多肽中N—H的伸縮振動(dòng)，并且螯合反應(yīng)導(dǎo)致更低的波數(shù)3301.68 cm-1，這表明多肽中的N—H的電子云密度由于誘導(dǎo)效應(yīng)或偶極場(chǎng)效應(yīng)而變得更強(qiáng)[24，25]。氨基顯示增加的N—H拉伸頻率，這意味著N—H參與螯合物形成。酰胺I帶的紅外吸收主要表示由羧酸離子的伸縮振動(dòng)[26]引起的C=O吸收，圖8從1649.06 cm-1移到較高的波數(shù)螯合反應(yīng)后為1651.83 cm-1。在1547.85 cm-1處的帶對(duì)應(yīng)于COO—轉(zhuǎn)移到1550.77 cm-1，圖9從1657.08 cm-1移到較低的波數(shù)螯合反應(yīng)后為1654.88 cm-1。在1543.04 cm-1處的帶對(duì)應(yīng)于COO—轉(zhuǎn)移到1550.94 cm-1，圖10從1658.88 cm-1移到較低的波數(shù)螯合反應(yīng)后為1654.93 cm-1。在1543.01 cm-1處的帶對(duì)應(yīng)于COO—轉(zhuǎn)移到1544.96 cm-1，這表明—COOH可能結(jié)合Zn并轉(zhuǎn)化為—COO—Zn。這種類型的螯合是固有的，因?yàn)轸驶蹙哂蟹擎I合的自由電子對(duì)來(lái)螯合Zn離子[27]。由于N—H鍵的彎曲振動(dòng)和C—N鍵的拉伸，圖8在1400.22 cm-1處的弱吸收帶（代表酰胺II帶）在加入鋅之后轉(zhuǎn)移到更深的谷峰（1405.47 cm-1）。圖9在1403.92 cm-1處的弱吸收帶（代表酰胺II帶）在加入鋅之后轉(zhuǎn)移到更深的谷峰（1402.28 cm-1）。圖10在1404.17 cm-1處的弱吸收帶（代表酰胺II帶）在加入鋅之后峰強(qiáng)度增加（1402.27 cm-1）。指紋區(qū)域的1240.28 cm-1的峰在1139.93 cm-1處轉(zhuǎn)移至較低頻率以形成C—O—Zn，同時(shí)峰強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of reaction time on the chelation reaction

圖8 多肽1與多肽1-Zn紅外光譜圖Fig.8 polypeptide 1 and polypeptide 1-Zn FTIR spectrum

圖9 多肽2及多肽2-Zn紅外光譜圖Fig.9 polypeptide 2 and polypeptide 2-Zn FTIR spectrum

圖10 多肽3及多肽3-Zn紅外光譜圖Fig.10 polypeptide 3 and polypeptide 3-Zn FTIR spectrum

總體而言，峰強(qiáng)度和波數(shù)不同的光譜證實(shí)了多肽-鋅螯合物是一種新型化合物，與自由多肽不同。Zn主要通過(guò)羧基氧和氨基氮原子與肽結(jié)合。

4 結(jié)論

本論文使用NaOH對(duì)鉻革屑進(jìn)行堿水解，然后將水解液進(jìn)行濃縮處理，對(duì)濃縮液和Zn(CH3COO)2在不同條件下進(jìn)行螯合。根據(jù)條件的不同，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，得到如下結(jié)論。

無(wú)水乙醇和螯合液的體積比為8∶1時(shí)，再增加無(wú)水乙醇的用量螯合物的得率不會(huì)再有所上升。此時(shí)既能使螯合物的產(chǎn)率達(dá)到最大，也不會(huì)造成無(wú)水乙醇的浪費(fèi)。對(duì)于三種不同分子量水解多肽最佳的螯合反應(yīng)條件有所差異，多肽1分子量為2995，反應(yīng)pH為8，多肽與Zn(CH3COO)2質(zhì)量比為7∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，螯合率最高為66.83%。多肽2分子量為1026，反應(yīng)pH為8，多肽與Zn(CH3COO)2質(zhì)量比為7∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，螯合率最高為75.33%。多肽3分子量為680，反應(yīng)pH為7，多肽與Zn(CH3COO)2質(zhì)量比為6∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，螯合率最高為82.56%。利用紅外對(duì)肽鋅螯合物進(jìn)行表征，結(jié)果可以證明多肽與鋅進(jìn)行了螯合反應(yīng)，形成比較穩(wěn)定的肽鋅螯合物。

對(duì)于多肽與Zn的螯合，不僅可以促進(jìn)生物體對(duì)Zn的生物利用度，作為農(nóng)業(yè)有機(jī)肥料成本較低，而且更好地使得皮革固體廢棄物回收利用，減少皮革廢棄物對(duì)環(huán)境的污染，促進(jìn)制革行業(yè)的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)條件及其結(jié)果對(duì)于其他微量元素與多肽的螯合物制備具有一定參考價(jià)值。