谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在植物響應(yīng)冷脅迫方面的研究進展

宋文，單春會，寧明，張琴，周發(fā)科，唐鳳仙

石河子大學食品學院（石河子 832000）

冷脅迫是限制植物生長、發(fā)育以及部分地區(qū)經(jīng)濟作物產(chǎn)量的主要非生物因素之一[1]。當植物遭受到低溫脅迫時，質(zhì)膜首先受到傷害，金屬離子、代謝物、營養(yǎng)交換及調(diào)節(jié)細胞過程等生理代謝功能發(fā)生紊亂，葉綠體、線粒體膜上的酶活力降低，光合作用和呼吸作用受到抑制，影響相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，進而影響植物的正常生長代謝[2-4]。受到冷脅迫的植物體內(nèi)ROS、MDA、H2O2等聚集積累，含量增加，活性氧的產(chǎn)生與清除動態(tài)平衡被打破，致使細胞內(nèi)的代謝水平失常，從而導致細胞及組織的凋亡，影響植物正常生長[5-8]。為了克服這一障礙，植物在進化過程中產(chǎn)生了各種適應(yīng)性機制，通過調(diào)控相關(guān)基因的特異性表達，在植物體內(nèi)誘導一系列復雜的生理生化變化來應(yīng)對外界的低溫環(huán)境，其反應(yīng)主要包括：誘導Ca2+和ABA的瞬時增加，脂質(zhì)組成的改變，抗氧化活性的增加和滲透保護劑的積累[9-12]。在抗氧化活性增加的過程中，植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)包括抗氧化酶防御系統(tǒng)和非酶抗氧化防御系統(tǒng)兩種自我防護體系[13-14]。其中抗壞血酸（Aseorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（Redueed glutathione，GSH）、類胡蘿卜素（Carotenoids，car）等抗氧化劑屬于非酶促系統(tǒng)中的主要抗氧化物[15-17]。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST，EC2.5.1.18）是一種多功能酶，可以催化還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和疏水、親電底物的共價結(jié)合，形成共軛物，隔離在液泡或轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體，從而對內(nèi)源和外來有害物質(zhì)進行降解，以達到降低細胞損害的作用[18-21]。GSTs的功能主要體現(xiàn)在3個方面：（1）催化與自身代謝物的結(jié)合反應(yīng)；（2）結(jié)合植物化合物，使其在細胞之間穿梭運輸；（3）催化依賴GSH的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)[22-23]。GST在真核生物和原核生物中普遍存在，國內(nèi)外有許多學者在植物、動物、真菌和細菌中對其進行了研究。在高等植物中，GST被分為八類，包括Phi（GSTF），Tau（GSTU），Lambda（GSTL），脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR），Theta（GSTT），Zeta（GSTZ），EF1Bγ和四氯氫醌脫鹵素酶（TCHQD）[24]。在最近報道的植物GST分類中，新增了蚯蚓血紅蛋白和Ⅰ兩類[25-28]。在這些亞家族中，Phi，Tau，Lambda和DHAR在植物中特異性表達。典型的GST蛋白含有兩個保守的活性位點：一個是N-末端結(jié)構(gòu)域中的GSH結(jié)合位點（G-位點），另一個是C-末端共底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（H-位點）。G位點特異于GSH并且主要影響催化功能，而H位點有助于特定底物的結(jié)合[29-30]。對GST在抵御低溫脅迫中的作用進行綜述，為進一步研究植物抵御冷脅迫的分子機制提供重要思路。

1 玉米中GST的研究進展

Kósa等[31]對三葉期的玉米幼苗進行0.01% S-甲基蛋氨酸（SMM）處理，室溫下培育1 d后轉(zhuǎn)入冷庫中。冷脅迫下，經(jīng)過0.01% S-甲基蛋氨酸（SMM）處理的樣品中谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性均高于對照組，而ROS（活性氧）水平低于對照組。結(jié)果表明，經(jīng)過S-甲基蛋氨酸（SMM）處理的玉米幼苗可通過可誘導谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶及愈創(chuàng)木酚過氧化物酶等酶的大量表達來維持細胞的ROS平衡，增強玉米對冷脅迫的耐受性。

Mahfuzur等[32]將耐冷型玉米BARI hybrid maize-7幼苗培育至兩葉期，隨后將其置于4 ℃環(huán)境中進行培育。與對照組相比，隨著應(yīng)激時間的延長，GST的活性增加，而過氧化氫酶（CAT）的活性相對降低。隨后免疫印跡分析（Western blot analysis）表明在冷脅迫期間，GST在幼苗體內(nèi)顯著積累。H2O2含量在冷脅迫初期先增加，隨著GST活性的增加，H2O2含量趨于穩(wěn)定狀態(tài)，表明GST在耐冷型玉米中的表達可減輕H2O2對玉米細胞結(jié)構(gòu)造成的氧化損傷，維持植物在冷脅迫下的生長。

Gábor等[33]對發(fā)芽期的玉米（Zea maysL.）進行羥胺衍生物BRX-156處理，隨后置于低溫環(huán)境中（5℃）培育一周。待樣品生長至三葉期后通過復合脅迫活力試驗（CSVT）確定幼苗中BRX-156對冷脅迫耐受性最大時的有效濃度。結(jié)果表明，與未經(jīng)處理的樣本相比，玉米中的谷胱甘肽還原酶在50 mg·L?1BRX-156的誘導下活性增加了150%，幼苗的根、莖、鮮重分別高于對照組，表明經(jīng)過BRX-156處理的玉米可通過誘導GST的大量表達，從而提高植物的抗寒性。

2 薯類GST的研究進展

Liu等[34]取生長旺盛的甘薯（Ipomoea batatsL.）植株的莖尖或尚未分化的腋芽，經(jīng)消毒后，切成段，接種到瓊脂含量為1.8%的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27±2 ℃，光照約2 000 Lux。待無菌苗生長到約3 cm高時，選取生長旺盛的健康無菌苗，置于4 ℃冰箱，低溫誘導24 h后提取總RNA，同時提取常溫生長對照組的總RNA，隨后利用RT-PCR擴增IBGSTU1基因的編碼區(qū)片段，并對產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Western blotting的分析結(jié)果顯示，經(jīng)過冷脅迫，甘薯組織在蛋白質(zhì)水平上也能檢測到IBGSTU1基因的表達，說明甘薯IBGSTU1基因是誘導型表達，并且具有組織表達差異性，冷脅迫能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上誘導IBGSTU1的響應(yīng)，協(xié)助保護組織免受傷害。

Sepp?nen等[35]從耐冷型的馬鈴薯S.commersonii中克隆并鑒定了一種新型低溫調(diào)節(jié)GST——Solanum commersonii谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Scgst1），并在轉(zhuǎn)錄組學水平研究了Scgst1的耐冷機制。在經(jīng)過過氧化氫和水楊酸處理的樣品中檢測到較強的mRNA信號，因此得出結(jié)論：Scgst1與早期活性氧物質(zhì)（AOS）的調(diào)節(jié)相關(guān)。隨后在快速形成AOS的試驗條件下發(fā)現(xiàn)Scgst1在S.commersonii中顯著積累。在同一條件下，盡管在不耐冷型S.tuberosum中發(fā)現(xiàn)了Scgst1序列，然而并沒有檢測到Scgst1的積累。推斷：相比于不耐冷型的S.tuberosum，耐冷型的S.commersonii中Scgst1的大量積累與表達可以降低低溫對馬鈴薯細胞的損害，從而提高S.commersonii品種的耐冷性。

在后續(xù)研究中，Sepp?nen等[36]在低溫下對不耐冷型的S.tuberosum與耐冷型的S.commersonii中的glutathione S-transferase（ScgstF1）、heat shock cognate 70 kDa（Schsc70）以及dehydrin2（Scdnh2）等耐冷因子進行深入研究。熒光定量試驗結(jié)果（q-PCR）顯示S.commersonii和S.tuberosum的光合作用在霜凍期間均有所下降，而在S.tuberosum中，光合作用的下降程度更大并且表現(xiàn)為不可逆型。與此同時，相比于S.tuberosum，在S.commersonii中檢測到ScgstF1和Scdhn2的大量積累。進一步發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過冷馴化和H2O2處理的樣本中，ScgstF1和Scdhn2在S.commersonii中均有大量積累，而在S.tuberosum中，只有Schsc70有所積累。結(jié)果表明，ScgstF1等耐冷因子可通過影響馬鈴薯的光合作用從而改變其耐冷性，H2O2預(yù)處理對ScgstF1等耐冷因子的表達與積累有積極作用。

3 水稻中GST的研究進展

作為人類的主要糧食作物，水稻在自然環(huán)境下容易受到冷脅迫的侵襲。為了解水稻對冷脅迫的響應(yīng)機制，Zhao等[37]對耐寒型麗江新源河谷粳稻品種（LTH）進行低溫（8 ℃）處理，隨后進行全基因組表達分析，分別選取6，12，24和48 h四個時間點的樣品進行RNA提取及生信分析。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，在抗氧化酶基因中發(fā)現(xiàn)了19種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），其中有14種GST基因上調(diào)表達。在響應(yīng)冷脅迫期間，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）基因（Os04g0556300）也有類似的特異性表達，這表明谷胱甘肽酶可以作為LTH中的活性氧物質(zhì)（ROS）清除劑。

Takesawa等[38]從玉米中提取了zeta-glutathione-S-transferase基因，隨后通過土壤桿菌（Agrobacterium）將其導入到87株水稻中。在后期驗證試驗中，轉(zhuǎn)基因品系的幼苗在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強的萌發(fā)和生長速率。結(jié)果表明，低溫脅迫下，轉(zhuǎn)zeta-glutathione-S-transferase植物GST活性的增強可能調(diào)節(jié)與冷脅迫相關(guān)基因的表達以降低活性氧水平，增強植物耐低溫能力，提高植物的存活率。

Wang等[39]培育了野生型（對照組）、OsSPX1轉(zhuǎn)基因系植株與反OsSPX1轉(zhuǎn)基因系植株，并發(fā)現(xiàn)OsSPX1表達的下調(diào)與水稻幼苗對冷脅迫的高度敏感性密切相關(guān)。在冷脅迫下，與野生型和OsSPX1轉(zhuǎn)基因株系相比，反OsSPX1基因株系幼苗葉片中積累了大量的過氧化氫。水稻全基因組GeneChip分析顯示，OsSPX1可通過促進谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、P450s等氧化應(yīng)激標記基因以及Pi-信號傳導途徑及相關(guān)基因（OsPHO2）的上調(diào)表達，從而提高轉(zhuǎn)基因株系的耐冷性。

目前GST中有關(guān)Lambda家族蛋白的相關(guān)研究較少，Kumar等[40]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsGSTL2屬于GST中Lambda類成員，在抵御冷脅迫方面有積極作用。隨后將OsGSTL2導入到擬南芥中在不同脅迫條件下培養(yǎng)，分析表明OsGSTL2對冷脅迫和其他非生物脅迫（如重金屬、滲透脅迫和鹽）具有耐受性，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因系植株的發(fā)芽率、根長、GST活性更高。結(jié)果表明，OsGSTL2通過增強擬南芥體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)從而提高植物對冷脅迫的耐受能力。

4 其他植物中GST的研究進展

南瓜（Cucurbita maxima）營養(yǎng)豐富，是一種重要的經(jīng)濟作物，然而低溫會影響它們的生長，嚴重影響其產(chǎn)量。Abdul等[41]將耐冷型的C.maxima（CP-1）和冷敏感型的C.moschata（EP-1）南瓜幼苗分別置于5，10和15 ℃環(huán)境中進行培養(yǎng)，在0，6，24，48和72 h五個時間點對樣品的葉片進行RNA提取，同時對根部、莖、花朵進行采樣，后期用作器官特異性表達分析。分析結(jié)果顯示，在冷脅迫下總共鑒定到32個GST基因，所有CmaGST基因在CP-1（C.maxima）和EP-1（Cucurbita moschata）中均特異性表達，其中7個（CmaGSTU3，CmaGSTU7，CmaGSTU8，CmaGSTU9，CmaGSTU11，CmaGSTU12和CmaGSTU14）在CP-1中均上調(diào)表達，其中18個CmaGST屬于tau類。在CP-1的20條染色體中，CmaGSTs分別在其中13條上有所表達，4號和6號染色體上的數(shù)量最多。CmaGST的上調(diào)表達緩解了冷脅迫對細胞的損傷，表明南瓜CmaGST在抵御冷脅迫過程中發(fā)揮著重要意義。

Yang等[42]研究了核桃（J.regia）中的tau亞家族谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因JrGSTTau1（Gene Bank No.：KT351091）。分別在16，12，10，8和6 ℃的條件下，發(fā)現(xiàn)JrGSTTau1在樣品中被應(yīng)激誘導。與野生型prokII（空載體對照）相比，瞬時轉(zhuǎn)化表明JrGSTTau1的核桃中GST、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）表達量較高，而過氧化物酶（POD）活性、H2O2、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）和電解質(zhì)流失率（EL）相對較低。為了進一步證實JrGSTTau1的作用，將JrGSTTau1導入煙草中進行異源表達，分別選擇轉(zhuǎn)基因系Line5，Line9和Line12進行分析。結(jié)果表明常溫下野生型植株，Line5，Line9和Line12的萌發(fā)狀態(tài)相似，但在冷脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的鮮重、初生根長和總?cè)~綠素含量顯著高于野生型植株。在后期培養(yǎng)過程中，轉(zhuǎn)基因煙草的GST和SOD活性顯著高于野生型。

馬建輝等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，AEGTA19581、AEGTA27563、AEGTA27835、AEGTA32578和AEGTA07316在山羊草（Aegilops tanschii）的根中顯著上調(diào)表達，而AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA32578和AEGTA07316在葉中也顯著上調(diào)表達，這表明GST基因在響應(yīng)低溫脅迫時，可能同時在根和葉中發(fā)揮著調(diào)控作用。

有研究表明花青素在植物響應(yīng)冷脅迫過程中具有調(diào)節(jié)作用，在此過程中，GST起到了運輸花青素的作用[44-45]。Carmona等[46]在Pa與Ma兩種血橙（C.sinensisL. Osbeck）4 ℃與9 ℃的低溫貯藏分別發(fā)現(xiàn)了8與4個GST，它們屬于Phi與Tau類。與4 ℃相比，GST-F12、GST-F9、GST-F6、GST-U1在9 ℃的條件下上調(diào)表達，與花青素的濃度表達趨勢一致，花青素含量越高，血橙耐冷性越好。結(jié)果表明，GST通過參與花青素的轉(zhuǎn)運從而調(diào)節(jié)血橙的耐冷性。

5 結(jié)語與展望

低溫脅迫是限制植物生長的主要環(huán)境因素之一[47-51]。在受到冷脅迫侵襲時，植物體內(nèi)會積累大量的ROS、MDA、H2O2等物質(zhì)，這些物質(zhì)的積累會破壞植物細胞中各種細胞器、蛋白質(zhì)等生物分子，破壞膜的完整性和功能，影響植物的正常代謝[52-53]。植物自身在抵御脅迫的過程中，酶促防御系統(tǒng)中GST可將GSH與H2O2催化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O，也可將有機氫過氧化物分解為醇類、水和GSSG，GSSG隨后被谷胱甘肽還原酶還原為GSH，然后通過GSH與過氧化物反應(yīng)，減少低溫脅迫對細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷[54-55]。

之前的研究證實GST在抵御冷脅迫及其他非生物脅迫方面扮演著重要的角色[56-59]。然而，在抵抗冷脅迫過程中植物GST的調(diào)節(jié)功能還是未知的，冷脅迫條件下GST是如何參與初級和次級代謝以及細胞信號傳導和調(diào)節(jié)功能、不同種類GST是如何發(fā)揮各自的作用、GST種類的差異性是否會對調(diào)節(jié)作用有影響以及這些GST具體是如何調(diào)控基因的表達及其與其它蛋白之間的關(guān)系等都有待于深入研究。在實際應(yīng)用方面，現(xiàn)在主要通過基因工程技術(shù)將GST相關(guān)基因?qū)肽康淖魑铮嘤鲂滦透弋a(chǎn)抗逆品種，用于對冷脅迫及其他脅迫具有增強抗性的轉(zhuǎn)基因作物的開發(fā)。但是當前轉(zhuǎn)基因技術(shù)還處于發(fā)展階段，其研究的安全性、轉(zhuǎn)基因相關(guān)的事例都還缺乏同時符合權(quán)威、科學、可信標準的渠道來解讀[60-61]。盡管植物抗脅迫基因工程的研究已經(jīng)取得了很多方面的進展，但是抗脅迫轉(zhuǎn)基因植物作為轉(zhuǎn)基因植物的一種，也會引發(fā)人們對其安全性的思考[62]。因此在未來的研究中，如何更加多元化、安全快捷地將GST應(yīng)用于作物抗逆性的研發(fā)將變得非常有必要。隨著轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學等研究方法的不斷發(fā)展，GST在冷脅迫條件下的調(diào)節(jié)功能和分子機制將得到進一步的研究，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的實際應(yīng)用也將得到發(fā)展，這也將對作物在冷脅迫下提高其耐冷性有重要意義。