硫酯酶功能蛋白鑒定及催化規(guī)律的研究進展

王佳，孫子羽，滿都拉，楊青，陳忠軍

內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院（呼和浩特 010000）

國家統(tǒng)計局公布2017年全國動植物油脂及其分解產品、精制的食用油脂、動植物蠟進口額為8 285 120萬美元，其出口額為839 440萬美元。我國國內對脂類產品有較高的需求，脂肪酸在食品、醫(yī)藥、化工等方面得到廣泛的應用，在國民經濟發(fā)展上具有不可替代的作用。

脂肪酸合成目前主要分為化學合成和微生物合成這兩種方式。相比于化學合成，微生物合成有著反應條件溫和、目標產物選擇性強、前體物質可進一步合成下游產物等優(yōu)點[1]，因此成為脂肪酸合成的研究熱點。被譽為“天然汽油”的微生物脂肪酸不僅種類繁多，而且脂肪酸組成與植物油脂相似[2]。

脂質合成代謝是一種多種酶參與的生化反應，其中硫酯酶是細胞脂肪酸合成、降解和轉運的關鍵酶，其活性決定機體代謝所產生的脂肪酸游離的形式。硫酯酶在生物合成脂肪酸過程中起到關鍵作用，深入研究硫酯酶功能及催化規(guī)律為解除脂酰輔酶A反饋阻遏奠定基礎。

1 硫酯酶的作用和分類

硫酯酶廣泛存在于動植物、微生物體內，能催化水解脂酰CoA和脂?；?ACP生成輔酶A（CoASH/CoA）、脂?；d體蛋白（Acyl carrier protein，ACP）以及其他含巰基的化合物，包括含有半胱氨酸殘基的蛋白質和肽，同時釋放出游離脂肪酸[3]。通過加強硫酯酶活性，促進脂酰CoA代謝，降低其累積量，從而提高了脂肪酸產量。硫酯酶的分類方式較多，可根據蛋白質中氨基酸序列或者底物的特異性等條件進行分類。目前較為認可的分類方法是以蛋白質一級結構中氨基酸的保守序列為主要分類標準，再參考硫酯酶的三級結構折疊域、折疊機制以及催化殘基位點對其進行分類[5]。硫酯酶（Thioesterase，TE）分為從TE 1到TE 23，基本涵蓋了所有類型的硫酯酶：?；?CoA型（TE 1～13）、?；?ACP型（TE 14～19）、聚酮型（TE 16，17）等[4]。

由于不同種類的微生物體中所含的硫酯酶的類型不同，常見的研究對象有原核微生物中大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）、谷氨酸棒狀桿菌（革蘭氏陽性）和放線菌渾濁紅球菌（革蘭氏陽性），以及真核微生物中酵母菌、高山被孢霉、微藻類。

2 原核微生物中硫酯酶的研究

基因工程是研究硫酯酶作用的普遍方式，其中大腸桿菌是最為常見的原核表達系統(tǒng)。Cao等[5]在大腸桿菌中表達擬南芥硫酯酶，其游離態(tài)脂肪酸的含量達到了總脂肪酸的37.5%；Voelker等[3]在大腸桿菌中表達加州月桂硫酯酶，重組菌中月桂酸超越棕櫚酸成為了主要脂肪酸，占到總脂肪酸的50.95%，而正常情況下大腸桿菌不產月桂酸，可見硫酯酶的表達還能使重組菌產生新的脂肪酸。谷氨酸棒狀桿菌作為發(fā)酵工程中重要的發(fā)酵菌種，也是硫酯酶研究的熱點。渾濁紅球菌是一種不僅對環(huán)境具有凈化作用的放線菌，同時也是脂肪含量較高的原核微生物。

2.1 大腸桿菌

大腸桿菌中脂肪酸合酶屬于典型的脂肪酸合酶（the fatty acid synthesase，FAS）Ⅱ系，它包括一系列酶分別獨立催化不同的反應。大腸桿菌硫脂酶主要以脂酰輔酶A 為水解底物，釋放出游離脂肪酸，同時能水解脂酰-ACP。在大腸桿菌中通過鑒定和表征研究的長鏈?；o酶A硫酯酶有硫酯酶I和硫酯酶Ⅱ，以及參與β氧化的硫酯酶Ⅲ。

2.1.1 硫酯酶Ⅰ

硫酯酶Ⅰ為周質酶，對細胞溶質中脂肪酸合成的作用不顯著。硫酯酶Ⅰ由具有催化三聯體Ser10-Asp154-His157的TesA基因編碼，屬于專一性水解12～18碳的脂酰輔酶A 。該酶的催化機制是絲氨酸殘基中羥基在組氨酸殘基的作用下親核攻擊?；?ACP和?；o酶A的硫酯鍵[6]。Steen等[2]在大腸桿菌中表達內源硫脂酶基因TesA，在搖瓶發(fā)酵的條件下游離脂肪酸含量為0.32 g/L。

’TesA（硫酯酶TesA刪除前導肽序列）可通過水解長鏈?；?ACPs來增強FAS活性[3]，從而解除長鏈?；?ACP對脂肪酸合成的抑制作用。當’TesA與其底物相互作用時，開關環(huán)（殘基75～80）的移動通過穩(wěn)定Michaelis復合物（MC）來影響底物特異性[7]。

在脂肪酸合成過程中，一定比例的’TesA與FAS組分對底物?；?ACP具有積極作用，降低FAS酶的反饋抑制。’TesA的另一種底物是?；o酶A，它抑制Ⅱ型脂肪酸合酶FabI的活性，’TesA在脂肪酸延伸中起關鍵作用。通過催化活性的’TesA的表達可以增加FFA產量，而’TesA的過度表達不具有這樣的作用[8]。

2.1.2 硫酯酶Ⅱ

硫酯酶Ⅱ是一種由TesB基因編碼的細胞溶質酶，對底物具有高活性，專一性水解6～18碳的脂酰-CoA。TesB和phaG基因之間具有相互調節(jié)作用，在大腸桿菌中共表達TesB和phaG基因，可促進重組菌3-羥基癸酸的生產[9]。

2.1.3 硫酯酶Ⅲ

硫酯酶Ⅲ是一種具有hotdog折疊的同型三聚體的長鏈?；o酶A硫酯酶，其對3, 5-十四碳二烯酰-CoA（油酸β氧化的次要代謝產物）最具活性。硫酯酶Ⅲ是一種相對疏水的可溶性蛋白質酶，其理論分子量為15-kDa單體。當油酸作為唯一碳源時，大腸桿菌中大部分脂肪酸在硫酯酶Ⅲ水解作用下進行β氧化至完全降解，僅約10%的油酸降解成3, 5-順式-十四碳二烯-CoA[10]。

2.2 谷氨酸棒狀桿菌

谷氨酸棒桿菌具有I型脂肪酸合成酶，革蘭氏陽性菌，由于其細胞壁不含脂多糖，所以有利于產物游離脂肪酸的分離純化。在谷氨酸棒桿菌中，硫酯酶參與?；o酶A的裂解，從而生成游離脂肪酸[11]。

野生型谷氨酸棒桿菌中硫酯酶活力比大腸桿菌中硫酯酶活力高出16倍左右，且其胞內不存在降解脂肪酸的β氧化途徑，有利于游離脂肪酸的合成與積累。Seiki等[12]通過高通量篩選獲得一株具有較高脂肪酸合成能力的谷氨酸棒桿菌突變株PCC-6，與野生型菌株相比，其脂肪酸產量由3.21 mg/L提高至279.95 mg/L，脂肪酸產量顯著提高。谷氨酸棒桿菌中可能存在三個脂酰CoA硫酯酶，其具體的分類以及作用待研究。

2.3 渾濁紅球菌

渾濁紅球菌從土壤中分離得到，屬于放線菌，革蘭氏陽性菌，可以分解有毒物質，是一種具有生物凈化污染土壤、合成生物能源的潛力菌株。此菌株是具有I型脂肪酸合成途徑的高產油脂微生物[13]。

渾濁紅球菌PD 630在不同碳源條件下，合成脂質積累量不同。Alvarez等[14]發(fā)現脂質產量最高的培養(yǎng)條件是以橄欖油為碳源，脂肪酸總量可占菌體干質量高達87%。

野生型渾濁紅球菌PD 630在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，其內源的四個硫酯酶基因表達水平隨發(fā)酵時間呈現不同的趨勢，其中TE2和TE4基因的表達水平隨菌體產脂速率的增加而增加，當菌體進入穩(wěn)定期后產脂速率快速降低時，兩者基因的表達水平也降至較低值；而TE1和TE3基因的表達水平則與菌體產脂沒有顯著相關性[13]。

3 真核微生物中硫酯酶的研究

目前分離出的真核生物硫酯酶，一般會通過基因工程技術轉化在酵母表達系統(tǒng)中，進一步研究其活性和作用。Stefan等[15]在耶氏解脂酵母中表達萼距花的硫酯酶CpFatB2，發(fā)現不僅提高了其總脂的含量，而且提高了不飽和脂肪酸的含量，其中油酸的含量占總脂肪酸的60%。郝昭程等[16]在畢赤酵母中表達擬南芥硫酯酶AtFatA后，顯示胞外游離態(tài)脂肪酸中的中鏈脂肪酸增加了51%，主要是辛酸。高山被孢霉作為高產脂質的菌種，其硫酯酶研究是一大熱點。微藻類作為光合自養(yǎng)的低等植，高山被孢霉作為高產物，其TE對調節(jié)脂肪酸組成的作用比較顯著。

3.1 酵母

作為油脂生產菌種，圓紅冬孢酵母在發(fā)酵罐水平上可獲得0.535 g油脂，包含35%飽和脂肪酸、46%的單不飽和脂肪酸以及其余多種多不飽和脂肪酸[17]；解脂耶氏酵母油脂含量可達到其自身細胞干質量的50%以上；通過引入異源腺嘌呤核苷三磷酸-檸檬酸裂解酶途徑、優(yōu)化關鍵代謝基因以及敲除競爭途徑的相關基因的方式，釀酒酵母在生產脂肪酸產量方面有著明顯的提高[18]。

釀酒酵母菌株△faa1△faa4，含有一種編碼短小的過氧化物酶體肌acyl-CoA TE的Acot5s基因，過表達此基因，游離脂肪酸（the free fattyacid，FFA）水平顯著提高。與野生型（the wild type，WT）菌株相比，工程菌株△faa1△faa4和△faa1△faa4[Acot5s]的細胞外脂肪酸顯著增加，表明硫酯酶Acot5s對FFA積累具有直接影響[19]。

釀酒酵母菌株△faa1△faa4[Acot5s]中胞漿?；鵆oA硫酯酶Acot5s的表達使總游離脂肪酸（FFA）產量增加至約500 μg/mL，與WT相比增加了6倍以上。Acot5s是一種非常有效的酶，可將?；鵆oA轉化為游離脂肪酸（FFA）。硫酯酶的表達增強了脂肪酸轉運能力，影響了關鍵代謝途徑中涉及的蛋白質的調節(jié)，從而導致主要的代謝重排，但同時不損害菌體的生長[20]。

3.2 油脂真菌高山被孢霉

高山被孢霉是一種高產脂質的絲狀真菌，其總脂的積累量可以達到細胞干質量的50%。它通過美國食品藥物管理局的安全性評估，既可作為食品級的工業(yè)產油微生物，也是脂質生物化學基礎研究的重要模式微生物[21]。

在油脂真菌高山被孢霉中有Acot8和Acot9兩種編碼硫酯酶的基因。Acot8是在羧基末端含有I型過氧化物酶體靶向信號并且位于過氧化物酶體中，而Acot9是線粒體硫酯酶，具有從細菌到人類的同源基因[22]。

Acot8酶可能對作為底物的CoA部分識別力較高，對硫酯化的?；溍舾卸容^低。在油脂真菌高山被孢霉細胞內脂質代謝中，過表達酰基CoA硫酯酶Acot8I時，重組菌株中總脂肪酸（the total fattyacid，TFA）含量與野生型高山被孢霉相同，游離脂肪酸（the free fattyacid，FFA）的產量從約0.9%（野生型）增加到2.8%（重組）。重組菌株中FFA含量中約為TFA的9%，而野生型油脂真菌高山被孢霉中含量約為TFA的1.3%；FFA中γ-亞麻酸和花生四烯酸含量分別約占4%和25%，而在野生型高山被孢霉中均未被檢測到。在油質真菌高山被孢霉中過表達Acot8I，增強了從?；鵆oA到FFA的通量，改善了FFA的產量并調整了脂質種類[23]。Acot8I對2～20個碳原子的酰基CoA具有異常廣泛的底物特異性[24]。

4 真核微藻

微藻是一類光合自養(yǎng)的低等植物，胞內脂質含量超過細胞干質量的20%，通過遺傳轉化的方法提高微藻的含油量，使其含油量超過干質量的80%以上，大多數含油微藻可以合成C16～C18脂肪酸[25]。在脂質研究中，常見的真核微藻主要有紅球藻、萊茵衣藻、三角褐指藻等，研究發(fā)現三角褐指藻的TE基因與植物FatA基因更相似。

TE表達與雨生紅球藻中脂肪酸合成之間存在線性相關性，TE在脂肪合成中處于關鍵的一步。Tan等[26]將杜氏鹽藻中TE引入萊茵衣藻，干質量中總脂質含量增加至15%，比野生型高56%。

將來自其他生物的TE基因轉化到微藻中，不僅可獲得目的油脂，還可以改善微藻的脂肪酸。例如Radakovits等[27]將來自香樟肉桂和加州月桂的兩種能合成特異性短鏈脂肪酸的TEs轉化到三角褐指藻中，發(fā)現C12∶0和C14∶0的百分比增加。由于異源TE對萊茵衣藻的ACP具有較低的親和力，來自植物C8～C12特異性TE引入萊茵衣藻時，未觀察到脂肪酸的變化，但是來自植物的C10～C14特異性TE基因被引入萊茵衣藻時，增強了C10～C14脂肪酸積累量[41]。TE的作用不僅僅在于脂肪酸的積累，更重要的是在調節(jié)脂肪酸的組成。

5 討論與展望

微生物的脂質代謝對于脂肪酸工業(yè)意義十分重大，掌握微生物脂質代謝規(guī)律更有利于進一步的研究。在脂肪酸合成過程中，脂酰CoA過量累積會起到反饋抑制作用，導致脂肪酸產量降低。硫酯酶不僅可以緩解脂酰CoA的反饋抑制作用，而且能促進脂肪酸的合成，還對生成脂肪酸種類、促進脂肪酸分泌于體外等相關功能有著重要的作用。

原核微生物不同菌種中其脂肪酸合成途徑也不同，基本分為FAS Ⅰ和FAS Ⅱ兩種系統(tǒng)。大腸桿菌是典型的FAS Ⅱ系統(tǒng)，谷氨酸棒狀桿菌和渾濁紅球菌是FAS Ⅰ系統(tǒng)，不同的脂肪酸合成系統(tǒng)對應的特點也不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，谷氨酸棒狀桿菌和渾濁紅球菌是革蘭氏陽性菌，渾濁紅球菌屬于放線菌屬，這三種原核微生物體內的硫酯酶的作用既有相同點也有較大的區(qū)別。

目前大腸桿菌的脂肪酸合成代謝研究比較清楚，對應的硫酯酶分類和作用也相對清晰，不僅含有TesA、TesB基因編碼的硫酯酶Ⅰ和Ⅱ，同時也含有β氧化中起到重要調節(jié)作用的硫酯酶Ⅲ。棒狀桿菌具有I型脂肪酸合成酶（FAS），由一種酶超復合物進行脂肪酸合成的連續(xù)循環(huán)，谷氨酸棒狀桿菌就是這種類型的菌種，與其他菌種相比，谷氨酸棒狀桿菌硫酯酶活性比較強。渾濁紅球菌在不同碳源的底物情況下，所合成的脂肪酸含量和種類也不同，作為高產脂質的菌種，其體內含有四種硫酯酶，其活性和作用位點不同，可分解的底物也不盡相同。

在真核微生物中，對酵母應用于生產脂肪酸方面的研究較多，不同的外源硫酯酶在酵母體內表達并能發(fā)揮其作用。真菌也應用于脂肪酸的研究，其中高山被孢霉最為突出。微藻作為低等植物，在改善脂質質量上有著不可替代的作用。

在酵母菌中ACOT 5s硫酯酶不僅對脂肪酸的合成而且對脂肪酸分泌具有促進作用；高山被孢霉體內的ACOT 8所編碼的硫酯酶不僅提高了脂肪酸含量而且增加了脂肪酸種類；在微藻類中引入不同的外源植物硫酯酶基因，不僅可以獲得較多種類的中鏈脂肪酸，而且能改善微藻脂質質量。

在以增加脂肪酸產量為目的的研究中，探討硫酯酶的功能蛋白鑒定及催化規(guī)律，在微生物合成脂肪酸中起著積極的作用。不同種類的硫酯酶調控不同的脂質合成代謝途徑。硫酯酶在脂質代謝中，不僅對脂肪?；鵆oA具有水解催化作用，還對脂肪酸的種類、轉移、分泌等過程具有不同程度的影響。隨著對硫酯酶的深入研究，將會為提高脂肪酸產量提供更多的可能。