典型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素污染物生物電化學(xué)降解研究

華 濤，李勝男，馮宇航，李鳳祥，劉巖婉晶，葛潤(rùn)蕾

（南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過(guò)程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300350）

微生物電化學(xué)技術(shù)（METs）可以去除水中污染物，同時(shí)產(chǎn)生電能或氫能，具有適用范圍廣、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)〔1〕。根據(jù)不同的應(yīng)用目的，可將METs分為微生物燃料電池（MFC）、微生物電解池、微生物脫鹽池以及用來(lái)還原陰極氧化物質(zhì)的微生物修復(fù)池〔2〕。目前，利用METs處理難降解有機(jī)廢水成為研究的熱點(diǎn)。其中，MFC可利用陽(yáng)極厭氧電活性菌將廢水中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能。影響MFC性能的因素有很多，包括電極間的距離、電極材料、反應(yīng)器構(gòu)型以及外接電阻〔3〕。相較于傳統(tǒng)的雙室MFC，單室空氣陰極MFC可直接利用空氣中的氧氣作為電子受體，容易得到更高的體積功率密度〔4〕。

水體中抗生素的污染已在全球范圍內(nèi)引起關(guān)注〔5〕。由于傳統(tǒng)的污水處理工藝忽略了對(duì)抗生素的控制，使得抗生素在水環(huán)境中未得到有效去除〔6〕?？股胤N類很多，其中紅霉素（ERY）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其可以通過(guò)和細(xì)菌核糖體中物質(zhì)的結(jié)合來(lái)阻斷蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而抑制細(xì)菌微生物的生長(zhǎng)與繁殖。因ERY結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，較難被微生物降解，在污水中經(jīng)常被檢測(cè)到。李侃竹等〔7〕分析發(fā)現(xiàn)，上海某污水處理廠污水中的ERY在47.5～49.2 ng/L。抗生素處于ng/L水平，雖對(duì)人體健康風(fēng)險(xiǎn)較低，但其在環(huán)境中長(zhǎng)期存在所帶來(lái)的潛在威脅不能忽視〔8〕。因此，加強(qiáng)水環(huán)境中抗生素的去除尤為關(guān)鍵。

研究表明，MFC對(duì)于抗生素類污染物具有較好的去除效果〔9〕。然而，目前針對(duì)單室空氣陰極MFC降解ERY的研究較少。本研究以ERY為目標(biāo)污染物，利用單室空氣陰極MFC對(duì)其進(jìn)行降解，研究了MFC系統(tǒng)對(duì)ERY的降解效果、產(chǎn)電能力及降解機(jī)制。此外，還對(duì)MFC陽(yáng)極膜上微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了檢測(cè)和分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本研究所用反應(yīng)器為單室空氣陰極MFC。其分為陽(yáng)極和陰極，陽(yáng)極一側(cè)為厭氧環(huán)境，需保證在全封閉狀態(tài)下；陰極則與空氣直接接觸。MFC由長(zhǎng)4 cm、橫斷面直徑3 cm的有機(jī)玻璃柱體組成，有效體積28 mL。MFC的陰極為碳布，將4層PTFE涂在其與空氣接觸的一側(cè)，并將0.5 mg/cm2Pt/C催化劑涂在另一側(cè)。MFC的陽(yáng)極為3K碳布，碳布使用前需經(jīng)丙酮浸泡12 h，然后依次用蒸餾水和乙醇沖洗，以去除表面雜質(zhì)，使微生物富集能力加強(qiáng)。將陰陽(yáng)極碳布（有效面積均為7 cm2）分別置于MFC兩側(cè)，并用橡膠圈進(jìn)行密封固定。將有機(jī)玻璃蓋蓋在陰陽(yáng)兩極上，其中陰極一側(cè)的蓋子是中空的，陽(yáng)極一側(cè)的蓋子則為密封的。利用鈦絲將陰陽(yáng)兩極連接。MFC外接1 000 Ω的電阻。組裝完成的MFC結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 MFC反應(yīng)器構(gòu)型和原理

1.2 MFC接種與穩(wěn)定運(yùn)行

將反應(yīng)器與PISO-813數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)連接，然后將反應(yīng)器置于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔30min采集一次數(shù)據(jù)，采樣精度0.001 V。MFC反應(yīng)器采用序批式培養(yǎng)，通過(guò)定期更換接種液完成啟動(dòng)。接種液來(lái)自實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行的MFC出水。以乙酸鈉為唯一碳源，50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（氯化銨0.31 g、氯化鉀0.13 g、磷酸二氫鉀2.88 g、磷酸二氫鈉4.09 g）為基底溶液。直到反應(yīng)器可以產(chǎn)生平穩(wěn)的輸出電壓（即最高電壓達(dá)500 mV以上），可認(rèn)為MFC啟動(dòng)成功。MFC啟動(dòng)成功后進(jìn)入正式運(yùn)行期，當(dāng)監(jiān)測(cè)到的輸出電壓＜50 mV時(shí)，需更換培養(yǎng)液，此過(guò)程記為1個(gè)周期。

1.3 電化學(xué)檢測(cè)

CV曲線和交流阻抗曲線（EIS）均由電化學(xué)工作站（CHI660E，辰華，中國(guó)）進(jìn)行測(cè)量。本研究測(cè)試采用三電極體系，以MFC的陽(yáng)極作為工作電極，陰極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，參比電極放在靠近陽(yáng)極一側(cè)。CV曲線電壓范圍-0.8～1.3 V，掃描速率50mV/s。EIS曲線頻率范圍100 000～1 Hz，振幅0.005 V。功率密度曲線和極化曲線采用改變外接電阻的方法，記錄電池兩端電壓，通過(guò)計(jì)算得到相應(yīng)數(shù)值。陽(yáng)極半徑為0.015 m；陰影面積為0.0007 m2。

1.4 紅霉素和COD檢測(cè)

ERY檢測(cè)：從反應(yīng)器中取2 mL水樣，在12 000 r/min下離心10 min，取1 mL上清液并過(guò)0.22 μm濾膜后，采用高效液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（ACQUITY UPLC I-CLASS/XevoTQ-S，Waters，Ireland）進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜檢測(cè)條件：波長(zhǎng)215 nm，C18柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和 0.1%甲酸水溶液（B），柱溫40℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序如表1所示。COD檢測(cè)：參照參考文獻(xiàn)〔10〕。

表1 梯度洗脫順序

1.5 MFC生物膜結(jié)構(gòu)和代謝活性檢測(cè)

利用激光共聚焦顯微鏡（LSM880 with Airyscan，Zeiss）分析MFC陰極、陽(yáng)極生物膜結(jié)構(gòu)和代謝活性。將MFC陰極、陽(yáng)極生物膜剪成適當(dāng)形狀，放入50 mmol/L的PBS溶液中浸泡，以洗去膜表面浮菌。然后用死活染色試劑盒（LIVE DEAD FIXABLE AQUA DEAD CE 1 KIT，Invitrogen）避光染色 20 min，再利用PBS緩沖液沖洗掉表面多余染料。激發(fā)譜線分別為488、543 nm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)切片選取4個(gè)視野觀察。利用生物顯微圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分析生物膜中活菌比例，為綠色熒光面積/總熒光面積。

1.6 MFC陽(yáng)極微生物多樣性檢測(cè)分析

采用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)比較MFC陽(yáng)極微生物群落在添加紅霉素前后的變化。將取下的MFC陽(yáng)極生物膜〔分別記為MFC_0（未添加紅霉素）和MFC_E（添加紅霉素）〕送至北京諾禾致源公司進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)所擴(kuò)增區(qū)域特點(diǎn)，基于Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)，利用單端測(cè)序方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序。通過(guò)對(duì)Reads剪切過(guò)濾，OTUs聚類（97%的一致性），并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品物種構(gòu)成；進(jìn)一步通過(guò)α多樣性分析、β多樣性分析挖掘樣品之間的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安和交流阻抗檢測(cè)

將啟動(dòng)成功的MFC分別用ERY以10、15、20、25、30 mg/L的質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行馴化。每個(gè)濃度運(yùn)行5個(gè)周期。在MFC產(chǎn)電達(dá)到最高峰時(shí)，以MFC陽(yáng)極為工作電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度下的CV曲線都有明顯的氧化還原峰，表明MFC中的陽(yáng)極生物膜具有電化學(xué)活性。當(dāng)ERY質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，氧化峰電位為-0.25 V，還原峰電流為-50 mA。隨著ERY濃度的升高，MFC的峰電流減小，峰電位不變，峰電流與ERY濃度呈負(fù)相關(guān)。此外，CV曲線圍成的積分面積即電極的活性面積隨著ERY濃度的升高而減小，說(shuō)明電極上的電量減小。推測(cè)造成該現(xiàn)象的原因是由于ERY的加入，使得MFC陽(yáng)極上的產(chǎn)電菌活性受到抑制，且ERY濃度（10～30 mg/L范圍內(nèi)）越大，對(duì)產(chǎn)電菌抑制性越強(qiáng)。

MFC的交流阻抗曲線（ERY初始質(zhì)量濃度為30 mg/L）如圖2所示。

由圖2可知，阻抗值為9 Ω，阻抗值較小，表明該MFC系統(tǒng)產(chǎn)生的阻抗損失較小，有利于該系統(tǒng)功率輸出。MFC中影響歐姆電阻的主要因素包括陽(yáng)極底物、陽(yáng)極產(chǎn)電菌群、電極材料、反應(yīng)器構(gòu)型和操作條件等。總的來(lái)說(shuō)，單室MFC內(nèi)阻低于雙室構(gòu)型MFC內(nèi)阻，底物為純物質(zhì)的內(nèi)阻低于混合底物內(nèi)阻，混菌構(gòu)建的反應(yīng)器內(nèi)阻低于純菌構(gòu)建的反應(yīng)器內(nèi)阻。

圖2 MFC交流阻抗曲線

2.2 MFC產(chǎn)電性能檢測(cè)

MFC的功率密度曲線和極化曲線（ERY初始質(zhì)量濃度為30 mg/L）如圖3所示。

圖3 功率密度曲線和極化曲線

由圖3可知，當(dāng)電流密度為1.4 A/m2時(shí)，可以獲得最大功率密度，為400mW/m2，此時(shí)電壓為297 mV。開(kāi)放電路電壓（OCV）是MFC系統(tǒng)中得到的最大電壓，其受到微生物種群與MFC陰極電勢(shì)的影響。由圖3可以看出，當(dāng)電流密度為0時(shí)，系統(tǒng)的OCV為0.54 V。當(dāng)電流密度在0～0.1 A/m2時(shí)，隨著電流密度的增加，輸出電壓劇烈減小，此時(shí)影響MFC的內(nèi)阻為活化內(nèi)阻。

對(duì)于本研究的MFC，獲得最大的功率輸出是最佳情況，即在最高電位下得到最大電流密度。此外，OCV是在外電阻無(wú)限大時(shí)得到的，本實(shí)驗(yàn)OCV接近550 mV。值得注意的是，輸出電壓隨著外阻的降低而降低。因此，為了在一定范圍內(nèi)得到最大的功率輸出，就需要在電流密度增大的過(guò)程中尋找最小的電壓降。

2.3 對(duì)ERY和COD的去除效果

在1個(gè)運(yùn)行周期（48 h）下，考察了MFC對(duì)30 mg/L ERY的去除效果。結(jié)果表明，ERY降解率為（83.21±1.4）%，COD 去除率為（84.91±2.1）%，COD 去除率略高于ERY降解率。同Ying Zhou等〔11〕利用MFC降解磺胺二甲嘧啶的去除率為99%相比，本研究抗生素降解率不是很高。根據(jù)A.Y.Lin等〔12〕利用臭氧氧化技術(shù)降解抗生素的研究推測(cè)，含有飽和C—C鍵的紅霉素比含有不飽和芳環(huán)的磺胺類抗生素的降解速率要慢。同T.T.Nguyen等〔13〕用膜反應(yīng)器降解醫(yī)用廢水時(shí)67%～78%的紅霉素降解率相比，本研究采用的MFC反應(yīng)器顯得優(yōu)勢(shì)大一些。MFC能夠降解ERY，結(jié)合下文的高通量檢測(cè)分析，推測(cè)是由于耐藥菌的作用，如已經(jīng)報(bào)道過(guò)的假單胞桿菌等〔14〕。

2.4 微生物群落分析

2.4.1 MFC生物膜結(jié)構(gòu)和代謝活性檢測(cè)分析

根據(jù)MFC陰極、陽(yáng)極生物膜激光共聚焦結(jié)果可知，未添加ERY的MFC陽(yáng)極生物量要比添加了ERY的多，推測(cè)是ERY抑制了部分菌群。對(duì)激光共聚焦顯微鏡生成圖片采用IPP軟件分析表明，生物膜相對(duì)代謝活性：未添加ERY的陽(yáng)極為0.574 9±0.002 5，添加ERY的陽(yáng)極為0.5754±0.0005，未添加ERY的陰極為0.9141±0.000 5，添加 ERY 的陰極為 0.729 4±0.000 3。未添加ERY的陽(yáng)極生物膜代謝活性與添加ERY的很接近，但是未添加ERY的陰極生物膜代謝活性明顯大于添加ERY的。

2.4.2 微生物種群多樣性和豐度

根據(jù)物種豐富度指數(shù)Chao1分析得到：在Ion S5TMXL測(cè)序平臺(tái)得到MFC_0、MFC_E樣本對(duì)應(yīng)的原始數(shù)據(jù)分別為83 145條、82 129條；進(jìn)行嵌合體過(guò)濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)分別為80 284條、80 100條。物種豐度指數(shù)估計(jì)的最大OTUs數(shù)：MFC_0為 315，MFC_E 為 302，MFC_0比 MFC_E 群落物種豐富度高。MFC_0的群落具有較高的多樣性（Shannon=4.949，Chao1=311.9），而 MFC_E 群落的多樣性相對(duì)較低（Shannon=4.482，Chao1=299.463）。 綜合分析Chao1和Shannon多樣性指數(shù)可知，ERY的加入對(duì)MFC陽(yáng)極微生物群落的豐富度及多樣性都有影響，加入ERY的陽(yáng)極生物膜物種豐富度和多樣性均有所降低。稀釋曲線如圖4所示。

圖4 稀釋曲線

稀釋曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。由圖4可知，曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種（OTUs）。另外，從圖4還可以看出，MFC_E的物種豐富度比MFC_0要低，物種數(shù)目較少。

2.4.3 微生物群落差異性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MFC_E和MFC_0中總的OTUs數(shù)有325個(gè)，其中276個(gè)OTUs為兩者共同含有。兩者共有的OTUs中，微生物大多屬于變形菌門（Proteobacteria）。總的來(lái)說(shuō)，2個(gè)樣品的微生物群落有差異，但相同物種的數(shù)量較為穩(wěn)定；兩者共有的OTUs中，產(chǎn)電菌豐富，這類菌的存在使得MFC得以高效運(yùn)行。

在門水平上，MFC_E和MFC_0中的微生物群落存在差異，但優(yōu)勢(shì)物種都為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。MFC_E與MFC_0相比，變形菌門（Proteobacteria）的菌種相對(duì)豐度增加（MFC_E:75.8%，MFC_0:67.4%）。推測(cè)是ERY的加入對(duì)陽(yáng)極生物膜的群落結(jié)構(gòu)造成較大影響，具有抗藥性的菌種富集在MFC的陽(yáng)極膜上，而沒(méi)有抗藥性的菌種得到抑制，使得優(yōu)勢(shì)物種豐度減小。優(yōu)勢(shì)菌種類變化，可能是具有抗性基因的菌種存活，沒(méi)有相關(guān)抗性基因的菌種則受到抑制。

MFC_E和 MFC_0中，變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）4門表現(xiàn)出明顯差異，厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）4 門所占比例較為接近。其中厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）是現(xiàn)有研究中產(chǎn)電菌、抗生素抗性菌中出現(xiàn)較多的菌種，這3類細(xì)菌門的總和占總序列數(shù)的比：MFC_0為71.72%，MFC_E為83.53%，此結(jié)果和上述2組樣品共有的OTUs結(jié)果相同。

2.4.4 ERY對(duì)功能菌群落結(jié)構(gòu)影響

屬水平上的OTUs序列數(shù)如表2所示。

表2 屬水平上不同陽(yáng)極微生物群落中產(chǎn)電菌、抗生素抗性菌相對(duì)豐度

由表2可知，目前已報(bào)道的產(chǎn)電菌占每個(gè)總序列的相對(duì)豐度：MFC_0為60.45%，MFC_E為69.46%，即加ERY后的產(chǎn)電菌增加了1.15倍。目前已報(bào)道的抗生素抗性菌占每個(gè)總序列的相對(duì)豐度：MFC_0為17.79%，MFC_E為32.26%，加有ERY后馴化得到的陽(yáng)極膜上的微生物群落抗性菌增加了1.81倍。其中地桿菌（Geobacter）為2個(gè)樣品產(chǎn)電菌中的優(yōu)勢(shì)菌。

綜上所述，報(bào)道中經(jīng)常見(jiàn)到的產(chǎn)電菌、抗生素抗性菌在2個(gè)樣品中都有檢出，如產(chǎn)電菌：地桿菌（Geobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、梭菌屬（Clostridium）〔15〕；抗生素抗性菌：假單胞菌（Pseudomonas）、分支桿菌（Mycobacterium）?？梢?jiàn)，樣品中的產(chǎn)電菌種類相對(duì)豐富，抗生素抗性菌在ERY的馴化過(guò)程中得到了富集。在長(zhǎng)期的馴化后，ERY不僅減弱了對(duì)微生物的抑制作用，抗性菌的相對(duì)豐度反而稍有所增加。所以，通過(guò)MFC處理抗生素時(shí)，一旦MFC馴化啟動(dòng)成功，基本上不需考慮ERY加入后對(duì)電池性能產(chǎn)生的影響。

3 結(jié)論

（1）隨著ERY濃度的升高，MFC的峰電流減小，峰電位不變，峰電流與ERY濃度呈負(fù)相關(guān)。CV曲線的面積隨著ERY濃度的升高而減小。由于ERY的加入，MFC陽(yáng)極上的產(chǎn)電菌活性受到抑制，ERY濃度越大，對(duì)產(chǎn)電菌活性抑制性越強(qiáng)。

（2）采用MFC降解質(zhì)量濃度為30 mg/L的ERY，最大功率密度為400 mW/m2，開(kāi)路電壓為0.54 V，ERY 降解率為（83.21±1.4）%，COD 去除率為（84.91±2.1）%。

（3）ERY的加入使MFC中微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但ERY加入前后的主要物種仍相同且數(shù)量較大，共有的OTUs中，71.72%的菌種為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria），這3類為主要的產(chǎn)電菌門，為微生物燃料電池的性能發(fā)揮了重要作用。