好氧反硝化菌BN5降解苯酚的特性研究

李耀東，王國(guó)英

（太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西太原030024）

近年來(lái)國(guó)內(nèi)地表水和地下水受苯酚及硝態(tài)氮污染較為嚴(yán)重，其中苯酚具有高毒性及潛在的致癌性，對(duì)動(dòng)植物及人類健康均有較大危害〔1〕。目前，降解水中苯酚的方法主要有化學(xué)法（如高級(jí)氧化法〔2〕、超臨界水氧化法）、物理法（如混凝法、微波法、超聲波法、吸附法、電催化、光催化及二氧化鈦催化）和生物降解法，其中生物降解法因具有處理成本低、二次污染小、處理效率高的優(yōu)點(diǎn)，在含酚廢水處理中得到廣泛應(yīng)用。

同傳統(tǒng)硝化脫氮工藝相比，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化具有比較突出的優(yōu)點(diǎn)：（1）異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌能同步進(jìn)行硝化、反硝化作用，即可在同一反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，節(jié)省了占地面積及成本〔3〕；（2）在反硝化過(guò)程中產(chǎn)生的堿度能中和硝化過(guò)程中產(chǎn)生的酸度，從而使得系統(tǒng) pH 保持相對(duì)穩(wěn)定〔4-5〕；（3）水中有機(jī)物可以作為碳源的特性使得好氧反硝化菌能在異養(yǎng)硝化時(shí)同步去除水中高濃度有機(jī)物，克服了傳統(tǒng)硝化池不耐有機(jī)負(fù)荷的缺點(diǎn)〔6〕。

目前，對(duì)好氧反硝化處理硝態(tài)氮時(shí)以苯酚為底物的研究相對(duì)較少。Jianhang Zhu等〔7〕使用長(zhǎng)期馴化的污泥在厭氧條件下處理含有苯酚和硝態(tài)氮的合成廢水，結(jié)果表明，苯酚和硝態(tài)氮降解率分別為93.3%和98.0%。張小妹等〔8〕在厭氧條件下進(jìn)行了全程反硝化降解苯酚和硝態(tài)氮的研究，結(jié)果表明，苯酚和硝態(tài)氮降解率分別為83%、99%；PCR-DGGE及切膠測(cè)序顯示，菌群以變形菌綱及擬桿菌綱為主。Qilong Ge等〔9〕從焦化廢水中分離出一株能夠降解苯酚、異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的菌株Diaphorobacter sp.PD-7，用其處理含有苯酚和硝態(tài)氮的水體，結(jié)果表明，當(dāng)苯酚初始質(zhì)量濃度為1 400 mg/L時(shí)，65 h的苯酚降解率為100%，硝態(tài)氮降解率達(dá)91%。

本實(shí)驗(yàn)研究了菌株 Pseudomonas sp.BN5〔10〕在硝態(tài)氮為唯一氮源、苯酚為唯一碳源時(shí)的好氧反硝化特性。采用單因素法對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使用Haldane方程對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行了擬合，并通過(guò)好氧反硝化關(guān)鍵酶酶活及氮平衡分析研究了異養(yǎng)硝化、好氧反硝化降解特性。該項(xiàng)研究可為好氧反硝化菌的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用假單胞菌Pseudomonas sp.BN5分離自活性污泥〔10〕。

LB 培養(yǎng)基〔11〕：胰蛋白胨 10 g/L，酵母浸出粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH=7。

好氧反硝化（DM）培養(yǎng)基〔12〕：苯酚按需加入，NaNO30.25 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.02 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，1 mL微量元素溶液，pH=7。

微量元素溶液：CuSO4·5H2O 0.08 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22 g/L，F(xiàn)e2（SO4）3·H2O 0.01 g/L，Na2MoO4·2H2O 1.26 g/L，MnSO4·4H2O 2.03 g/L，H3BO32.86 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，pH=7。

以上培養(yǎng)基及所有實(shí)驗(yàn)器具于121℃高壓蒸汽鍋滅菌20 min，固體培養(yǎng)基另加16 g/L瓊脂粉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

取200 mL液態(tài)LB培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，將甘油冷凍保藏（-80℃）的菌種BN5常溫解凍，接種至培養(yǎng)基中，然后置于搖床恒溫振蕩培養(yǎng)（30℃，130 r/min）至指數(shù)生長(zhǎng)后期。取培養(yǎng)液離心（6 000 r/min，4℃，10 min）后，用 DDH2O 清洗 2次，備用。

1.2.2 苯酚降解條件優(yōu)化

采用單因素法研究好氧條件下pH、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株BN5好氧反硝化降解苯酚效果的影響，以確定最佳培養(yǎng)條件。在苯酚初始質(zhì)量濃度為420 mg/L的DM培養(yǎng)基中接種5%的BN5，設(shè)置培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h。

1.2.3 硝態(tài)氮去除與苯酚降解特性研究

在確定的最優(yōu)培養(yǎng)條件下，以5%的接種量接種BN5到苯酚初始質(zhì)量濃度為420 mg/L的DM培養(yǎng)基中，于搖床內(nèi)培養(yǎng)72 h。每隔6 h檢測(cè)苯酚、NO3--N、NO2--N含量及細(xì)胞濃度。

1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)及苯酚降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在最佳培養(yǎng)條件下，采用Haldane方程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。選取苯酚質(zhì)量濃度梯度：0～200 mg/L之間為每20 mg/L一個(gè)濃度梯度；200～600 mg/L之間為每100 mg/L一個(gè)濃度梯度。以5%的接種量接種BN5，在搖床中恒溫培養(yǎng)72 h。每隔6 h檢測(cè)各錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的OD600值及硝態(tài)氮含量。

1.2.5 酶活

（1）粗酶液提取〔6〕。以5%的接種量將菌株BN5接種于DM培養(yǎng)基中，在最佳條件下于搖床內(nèi)培養(yǎng)30 h后，離心 20 min（10 000 r/min，4℃）。取沉淀菌體，用磷酸緩沖液沖洗 3 次（0.01 mol/L，pH=7.4），使菌體細(xì)胞重新懸浮，再用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92-IIN）破碎細(xì)胞。 離心 20 min（12 000 r/min，4 ℃）后，取上清液，即為粗酶液，低溫保存待用。

（2）酶活分析〔13〕。硝酸還原酶（NAR）和亞硝酸還原酶（NIR）的測(cè)定體系（10 mL）：10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=7.4），0.2 mmol/L NADH，800 μL 粗酶液。分別加入10 μmol/L硝酸鈉、10 μmol/L亞硝酸鈉進(jìn)行反應(yīng)。NAR、NIR活性由反應(yīng)前后硝酸鈉、亞硝酸鈉消耗量得出?？偟鞍踪|(zhì)濃度測(cè)定采用Bradford法〔14〕。一個(gè)酶活力單位（U）定義為 1 min 催化 1 μmol底物所需的酶量，酶比活力（U/mg）定義為每毫克蛋白質(zhì)所含有的酶活力單位數(shù)。

1.2.6 氮平衡分析

在最佳條件下培養(yǎng)菌株BN5 72 h，離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）后，取上清液測(cè)定 TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N；取沉淀部分測(cè)定胞內(nèi)氮，進(jìn)行氮平衡分析。

1.3 測(cè)試與分析方法

參照參考文獻(xiàn)〔15〕進(jìn)行菌液濃度的測(cè)定；苯酚濃度采用液相色譜（P1201，大連依利特）儀進(jìn)行測(cè)定；NO3--N采用麝香草酚分光光度法測(cè)定；NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定；NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；胞內(nèi)氮采用元素分析儀（EA3000，意大利歐維特）進(jìn)行測(cè)定。有機(jī)氮為TN減去NO3--N、NO2--N、NH4+-N之和。數(shù)據(jù)分析采用Origin。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯酚降解影響因素

2.1.1 pH對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的影響

在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下，考察了pH（5、6、7、8、9）對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的影響

由圖1可知，隨著pH的升高，苯酚和硝態(tài)氮降解率呈先迅速升高后逐漸下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)pH=7時(shí)降解效果最佳，苯酚和硝態(tài)氮降解率分別為100%、93.31%。培養(yǎng)基pH偏低或偏高均會(huì)抑制菌株BN5的生長(zhǎng)和相關(guān)酶的活性。選擇pH=7為最優(yōu)pH。

2.1.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的影響

在pH=7的條件下，考察了搖床轉(zhuǎn)速（120、140、160、180、200 r/min）對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的影響

菌株BN5為好氧反硝化菌，改變搖床轉(zhuǎn)速可以控制培養(yǎng)基中溶解氧（DO）濃度。實(shí)驗(yàn)初期（1 h），轉(zhuǎn)速分別為 120、140、160、180、200 r/min 時(shí)，培養(yǎng)液 DO分別為（6.12±0.03）、（6.39±0.04）、（6.58±0.02）、（6.76±0.02）、（6.83±0.04） mg/L。 由圖 2 可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速＜180 r/min時(shí)，菌株BN5對(duì)苯酚及硝態(tài)氮的降解率隨轉(zhuǎn)速的增大而迅速提高。當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，苯酚和硝態(tài)氮降解率達(dá)到最大，分別為100%、93.31%。當(dāng)轉(zhuǎn)速＞180 r/min時(shí)，降解率則有所降低，原因可能是溶解氧不再是降解苯酚及硝態(tài)氮的限制因素，并且轉(zhuǎn)速太高菌體受到剪切作用，導(dǎo)致活性降低。選擇最優(yōu)轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2 菌株的硝態(tài)氮去除-苯酚降解特性研究

考察了菌株BN5對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的特性，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株BN5對(duì)苯酚降解和硝態(tài)氮去除的特性

由圖3可知，菌株經(jīng)過(guò)12 h的停滯期（0～12 h）后，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期（12～30 h），此時(shí)是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖最旺盛的時(shí)期，反硝化主要在這一階段完成，苯酚、NO3--N被迅速消耗。接種30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。在指數(shù)生長(zhǎng)期，苯酚質(zhì)量濃度從401.52 mg/L降到95.36 mg/L， 最大苯酚降解速率為 17.01 mg/（L·h），硝態(tài)氮從39.79 mg/L降至11.23 mg/L，最大硝態(tài)氮去除速率為1.59 mg/（L·h）。 在培養(yǎng)期末期，細(xì)胞濃度有所降低，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，細(xì)胞內(nèi)源呼吸導(dǎo)致。在實(shí)驗(yàn)周期72 h后，硝態(tài)氮為2.76 mg/L，硝態(tài)氮降解率為93.31%；苯酚濃度為0，苯酚降解率為100%。

另外，在指數(shù)生長(zhǎng)期有NO2--N積累，30 h時(shí)有最大積累，為6.58 mg/L。這可能是因?yàn)榉聪趸^(guò)程中產(chǎn)生的堿使得pH升高，抑制了相關(guān)酶的活性，使得NO2--N降解速率下降，而相對(duì)NO2--N，NO3--N的降解速率受抑制程度較低；隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，細(xì)胞濃度上升，底物去除速率增強(qiáng)，積累的NO2--N被去除〔9，16〕。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

本研究用Haldane方程描述高濃度苯酚降解動(dòng)力學(xué)，方程式：

式中：μ——細(xì)胞比生長(zhǎng)速率，h-1；

μmax——細(xì)胞最大比生長(zhǎng)速率，h-1；

S——有機(jī)底物質(zhì)量濃度，mg/L；

KS——飽和常數(shù)，mg/L；

Ki——抑制常數(shù)，mg/L。

當(dāng)菌株處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，μ為常數(shù)，即每個(gè)初始苯酚濃度S對(duì)應(yīng)的μ由其指數(shù)生長(zhǎng)期決定。對(duì)每一個(gè)濃度梯度試樣中指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞含量和時(shí)間的半對(duì)數(shù)圖做線性最小二乘擬合得到對(duì)應(yīng)μ值。

將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Origin軟件利用非線性最小二乘法進(jìn)行擬合，得到細(xì)胞生長(zhǎng)Haldane方程擬合曲線，見(jiàn)圖4。

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)吻合良好。方程動(dòng)力學(xué)參數(shù)：μmax=0.34 h-1，KS=12.88 mg/L，Ki=202.59 mg/L（R2=0.989）。由圖4還可看出，菌株比生長(zhǎng)速率在苯酚質(zhì)量濃度為51.54 mg/L時(shí)達(dá)最大；繼續(xù)增加苯酚濃度，由于底物抑制作用的增強(qiáng)，比生長(zhǎng)速率持續(xù)減小；當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度＜51.54 mg/L時(shí)，比生長(zhǎng)速率隨苯酚濃度減少而迅速下降，這是由于苯酚濃度較低，導(dǎo)致培養(yǎng)基中缺乏足夠的碳源供細(xì)胞生長(zhǎng)，使得底物限制作用起主導(dǎo)作用。

圖4 菌株BN5比增長(zhǎng)速率與Haldane模型回歸曲線

2.4 苯酚濃度對(duì)NAR、NIR活性的影響

苯酚初始濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和硝態(tài)氮去除的影響如圖5所示。

圖5 苯酚初始濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)（a）和硝態(tài)氮去除（b）的影響

由圖5可知，隨著苯酚初始濃度的增大，細(xì)胞生長(zhǎng)速率逐步降低，硝態(tài)氮去除耗時(shí)增長(zhǎng)，最終細(xì)胞濃度升高。說(shuō)明反應(yīng)體系中底物抑制作用隨苯酚濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，從而使得硝態(tài)氮去除速率降低，細(xì)胞生長(zhǎng)速率也隨之減小。而充足的碳源有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，較高濃度的苯酚也可能會(huì)有利于細(xì)胞進(jìn)行異養(yǎng)硝化，使得更多的碳源用于合成細(xì)胞，導(dǎo)致最終細(xì)胞濃度升高。

苯酚初始濃度對(duì)NAR、NIR活性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在初始苯酚質(zhì)量濃度分別為420、570、720 mg/L的3個(gè)反應(yīng)器內(nèi)提取的粗酶液中，NAR酶活分別為 0.112、0.097、0.074U/mg，NIR 酶活分別為 0.105、0.086、0.057 U/mg。說(shuō)明較高濃度的苯酚會(huì)抑制NAR和NIR的活性，且隨濃度升高其對(duì)NIR的抑制程度也逐漸增強(qiáng)。

2.5 氮平衡分析

菌株BN5好氧反硝化過(guò)程中的各類氮含量如表1所示，其中錐形瓶?jī)?nèi)初始DM培養(yǎng)基為200 mL。NO3--N是唯一氮源，所以最初NO3--N是氮的唯一形式，故TN為8.24 mg。

表1 菌株BN5好氧反硝化過(guò)程中氮平衡分析

可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，有機(jī)氮、NH4+-N及NO2--N出現(xiàn)積累，胞內(nèi)氮從0.41 mg增長(zhǎng)到4.61 mg，增長(zhǎng)量占TN去除量的54.6%。氮損失為39.4%，損失的這部分氮以含氮?dú)怏w的形式被去除〔6〕。菌株BN5在反應(yīng)過(guò)程中胞內(nèi)氮增加量與氮損失占初始TN的95.35%，說(shuō)明菌株BN5主要通過(guò)好氧反硝化作用和細(xì)胞同化作用脫氮〔9，17〕。

3 結(jié)論

（1）研究了菌株P(guān)seudomonassp.BN5利用NO3--N為電子供體，苯酚為唯一碳源進(jìn)行好氧反硝化的反應(yīng)特性。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)，得出最佳反應(yīng)條件：pH=7，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。在最佳條件下接種72 h，硝態(tài)氮去除率達(dá)93.31%，平均硝化速率為0.53 mgNO3--N/（L·h）；苯酚降解率達(dá) 100%，平均降解速率為5.83 mg苯酚/（L·h）。 在 30 h時(shí)有 NO2--N 最大積累，為6.58 mg/L。

（2）使用Haldane方程對(duì)菌株BN5細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果表明，曲線擬合度良好。在最佳菌株培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)：μmax=0.34 h-1，KS=12.88 mg/L，Ki=202.59 mg/L（R2=0.989）。

（3）較高的初始苯酚濃度會(huì)抑制苯酚降解，使得細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，但有利于細(xì)胞異養(yǎng)硝化，使得最終細(xì)胞濃度相比提高。NAR及NIR酶活隨苯酚濃度的升高而逐漸降低，且NIR受到的抑制程度較大。

（4）氮平衡分析表明，菌株BN5主要通過(guò)好氧反硝化作用及細(xì)胞同化作用脫氮。