布地奈德對脂多糖誘導大鼠急性肺損傷的影響

羅園 岳紅云 李世元

1河北醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院呼吸科,石家莊050011;2河北醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院燒傷科,石家莊050011

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)是由于非心源性原因引起的肺組織結構發(fā)生特征性的病理改變,其未控制后會進一步進展至急性進行性呼吸衰竭。ARDS是一種急性、彌漫性的炎癥性肺損傷,為常見的危及人類健康的呼吸危重癥之一,重癥ARDS患者在ICU病死率為40%～50%[1]。ALI/ARDS因治療效果差,給社會和患者家庭帶來了沉重的經濟負擔[2]。目前主要治療策略為抑制全身炎癥反應、呼吸支持治療等。布地奈德作為一種吸入糖皮質激素,推測對于ALI有治療作用。目前,有關吸入布地奈德對ALI的研究較為熱門,但對于其具體作用機制,仍未完全闡釋清楚。因此,本研究通過應用脂多糖 (lipopolysaccharides,LPS)建立大鼠ALI模型,觀察經氣道應用布地奈德對ALI大鼠的保護作用,并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 LPS(美國Sigma公司);布地奈德混懸液 (阿斯利康制藥有限公司,批號:320499);健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,體質量 (200±10)g(河北醫(yī)科大學實驗動物中心,合格證編號1605205)。Evans藍 (美國Sigma公司);BCA蛋白定量試劑盒 (美國Thermo公司)。細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICA M-1)(美國Abcam公司)。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 (上海欣博盛公司)。

1.2 檢測儀器 動物呼吸機 (美國Harvard公司,型號687);Odyssey雙色紅外熒光成像儀(美國LI-COR公司);Synergy-HT多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司);雙目顯微鏡 (日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 動物實驗方法經河北醫(yī)科大學倫理委員會審核通過。取健康清潔雄性SD大鼠30只,隨機分為3組:對照組、LPS組和布地奈德組,每組10只。對照組氣道注入生理鹽水1 ml;LPS組氣道注入LPS(5 mg/kg);布地奈德干預組氣道注入相同劑量LPS 24 h后,氣道注入布地奈德1 ml(500μg/kg)。

1.3.2 標本制作 給予藥物干預后24 h,麻醉,開胸,游離氣管和肺臟,結扎右主支氣管,取材,右肺上葉浸入4%多聚甲醛中固定,進行病理及免疫組織化學檢測,右肺下葉用于計算肺部濕干重比。左肺用4℃PBS灌洗,每次3 ml,共3次(回收率＞80%),回收的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)于4℃離心10 min(1200r/min,離心半徑13.5cm)后,上清液留存至-80℃保存,進行炎癥因子及蛋白含量檢測。離心沉淀制成細胞懸液后,用細胞計數(shù)板在光鏡下計數(shù),統(tǒng)計白細胞、上皮細胞等,細胞懸液圖片經瑞氏染色后,光鏡下根據(jù)形態(tài)學標準分類計數(shù)500個細胞。

1.3.3 檢測指標

1.3.3.1 病理學檢查 取右肺上葉,10%福爾馬林固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,5μm切片后進行HE染色并做肺部病理結構改變分析。采用Smith評分對肺組織有無毛細血管淤血、肺泡腔纖維蛋白滲出、中性粒細胞滲出、氣道黏膜上皮細胞脫落、肺泡間隔增寬等5項的輕重程度進行評分,每個標本分析10個高倍視野,取其平均值計算肺損傷評分。

1.3.3.2 免疫組織化學檢測ICAM-1表達 取石蠟標本,行4μm連續(xù)切片,梯度酒精脫蠟復水,常規(guī)修復抗原處理后孵育ICA M-1一抗 (1∶3 000)4℃過夜,同時以PBS代替一抗做陰性對照。孵育二抗 (1∶2 000)后DAB顯色,蘇木精復染細胞核,中性樹脂封片,光鏡下觀察ICAM-1陽性表達情況。

1.3.3.3 肺水清除率的測定 用1%戊巴比妥以2～3 ml/kg腹腔麻醉,氣管切開后進行氣管插管,接動物呼吸機,吸純氧行容量控制通氣,潮氣量為9～10 ml/kg,呼吸頻率為80～100次/min。用恒溫儀保持大鼠體溫為37℃。灌注液由5%牛血清蛋白及0.15 g/L Evans藍溶液配置。經氣管插管將灌注液以4 ml/kg緩慢灌入大鼠肺內,同時行機械通氣。1 h后放血處死動物。將肺組織整塊取下,以采樣管吸取右肺下葉內的肺泡液體0.2 ml,在波長620nm處測定Evans藍標記的白蛋白濃度,計算肺水清除率。肺水清除率=(Vi-Vf)/Vi×100%,Vf=Vi×Pi/Pf,式中Vi和Vf分別代表起始和最終肺泡液體總量,Vi表示灌注前,Vf表示孵育后,P表示Evans藍標記的白蛋白濃度。

1.3.3.4 肺濕干重比測定 取右肺下葉,濾紙吸干表面水分后稱量重量,置于96℃恒溫箱烤48 h至肺組織重量恒定后稱量重量,計算肺濕干重比。

1.3.3.5 ELISA檢測IL-1β表達水平 應用ELISA試劑盒,采用雙抗體夾心法,依次加入標準品及樣品、生物素化抗體工作液、酶結合工作液、顯色劑、終止液,應用酶標儀,即刻測量OD450(3 min內),在儀器保存讀數(shù)結果。以標準品的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪出標準曲線。根據(jù)樣品OD值,由標準曲線查出所測樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。符合正態(tài)方差齊的計量資料采用單因素方差分析(One-way ANOVA),進一步兩兩比較采用LSD法;不符合正態(tài)或方差不齊的計量資料采用非參數(shù)檢驗 (Kruskal-wallis Test)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計圖表繪制使用Graphpad軟件進行。

圖1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn) A:對照組;B:脂多糖組;C:布地奈德組 HE ×200

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn) HE染色結果(圖1)可見對照組肺組織結構完整,肺泡壁無水腫,無炎性細胞滲出;LPS組肺泡結構破壞,肺間質水腫,肺泡壁明顯增厚,炎癥細胞滲出,肺泡腔內可見少量水腫液滲出;布地奈德組肺組織結構破壞較LPS組明顯減輕,炎癥細胞滲出減少,肺泡滲出明顯減少,與對照組相比,肺泡結構破壞略增多。依據(jù)Smith評分,布地奈德組肺組織損傷評分較脂多糖組明顯減低 (圖2)。

2.2 各組大鼠肺組織中ICAM-1表達 免疫組織化學結果 (圖3)顯示,對照組肺組織可見少量淡黃色顆粒;LPS組可見肺泡間大量棕黃色顆粒聚集,較對照組明顯增多;布地奈德組可見少量散在淡染黃色顆粒,與LPS組相比明顯減少。黃色顆粒為ICA M-1免疫組織化學染色陽性表達顆粒。

2.3 各組大鼠肺水清除率 LPS組肺水清除率(14.80%±0.97%)較對照組 (29.98%±0.54%)明顯減低 (P＜0.01),布地奈德組肺水清除率(24.10%±1.27%)較LPS組明顯升高 (P＜0.01)。見圖4。

圖2 各組大鼠肺損傷評分的比較

2.4 各組大鼠肺濕干重比 LPS組肺濕干重比(6.35±0.21)較對照組 (3.99±0.07)升高 (P＜0.01),布地奈德組肺濕干重比 (5.28±0.12)較LPS組減低 (P＜0.05)。見圖5。

2.5 各組大鼠BALF中蛋白含量及細胞計數(shù)LPS組BALF中蛋白含量 [(0.85±0.06)g/L]較對照組 [(0.25±0.02)g/L]升高 (P＜0.01),布地奈德組BALF中蛋白含量 [(0.47±0.04)g/L]較LPS組降低 (P＜0.05)。見圖6。

圖3 各組大鼠肺組織中細胞間黏附分子1表達 A:對照組;B:脂多糖組;C:布地奈德組 免疫組織化學染色 ×200

圖4 各組大鼠肺水清除率的比較

圖5 各組大鼠肺濕干重比的比較

LPS組BALF中細胞總數(shù) [(10.62±0.36)×106/ml]較對照組 [(4.10±0.11)×106/ml]明顯升高 (P＜0.01),布地奈德組BALF中細胞總數(shù) [(6.03±0.13)×106/ml]較LPS組減低(P＜0.01)。見圖7。

LPS組BALF中中性粒細胞 [(8.71±0.32)×106/ml]較對照組 [(0.38±0.11)×106/ml]明顯升高 (P＜0.01),布地奈德組BALF中中性粒細胞 [(4.44±0.31)×106/ml]較LPS組減低(P＜0.01)。見圖8。

圖6 各組大鼠BALF中蛋白含量的比較

圖7 各組大鼠BALF中細胞總數(shù)的比較

LPS組BALF中巨噬細胞 [(2.07±0.08)×106/ml]較對照組 [(0.31±0.06)×106/ml]明顯升高 (P＜0.01),布地奈德組BALF中巨噬細胞 [(1.35±0.04)×106/ml]較LPS組減低(P＜0.01)。見圖9。

圖8 各組大鼠BALF中中性粒細胞的比較

圖9 各組大鼠BALF中巨噬細胞的比較

2.6 各組大鼠BALF中IL-1β表達水平 LPS組BALF中IL-1β表達水平 [(598±36.65)ng/L]較對照組 [(214±20.52)ng/L]升高 (P＜0.01),布地奈德組BALF中IL-1β表達水平[(406.5±20.03)ng/L]較LPS組明顯減低 (P＜0.01)。見圖10。

3 討論

在過去的幾十年中,ALI的病理生理機制及治療均有廣泛深入的研究,可是直到目前為止,ALI/ARDS患者的病死率仍居高不下[3]。ALI的主要病理改變?yōu)閺V泛的肺泡上皮細胞及毛細血管損傷、肺毛細血管通透性增加、肺泡蛋白水腫液滲出、炎性細胞浸潤、肺水腫形成,導致氣體交換障礙,引起進行性發(fā)展的難治性低氧血癥及呼吸困難[4]。本實驗通過給予布地奈德干預LPS致ALI大鼠,觀察相關指標變化,發(fā)現(xiàn)布地奈德可以減少肺泡結構破壞,減少BALF中炎癥因子IL-1β產生,降低蛋白水腫液、中性粒細胞、巨噬細胞的滲出,減少肺部炎癥反應的發(fā)生,對于ALI存在保護作用。

圖10 各組大鼠BALF中IL-1β水平的比較

肺水清除率在治療急性肺水腫中扮演了很重要的角色,肺水平衡是通過肺泡上皮細胞的鈉通道[5]、氯通道、Na+-K+-ATPase介導的離子梯度差來維持[6]。在新生兒及成人的肺臟中,糖皮質激素均可以調節(jié)鈉和水的轉運。血液中激素水平對于維持肺水平衡和肺水清除是十分重要的。糖皮質激素與細胞質內受體結合,信號傳導入細胞核內,特異性上調氣道上皮鈉通道m(xù)RNA水平,引起氣道上皮鈉通道表達增多[7],從而增強肺水清除,改善肺損傷。此外,有實驗表明在地塞米松干預后的H441氣道上皮細胞中,Na+-K+-ATPase的α1、β1亞基表達蛋白均有升高,且增強了鈉通道的轉運能力[8]。既往實驗多通過氣道注入或腹腔、靜脈注射地塞米松干預ALI進程,對于通過氣道給予布地奈德的干預實驗研究較少。布地奈德為糖皮質激素之一,與地塞米松相比,有較少的垂體腎上腺素軸抑制不良反應,且氣道給予,外周入血量極低,能更好地發(fā)揮治療作用,減少不良反應的發(fā)生。為了明確布地奈德對于ALI的影響,設計本實驗,結果證明通過布地奈德治療后,肺水清除率較LPS組明顯下降,對于減輕肺水腫有積極意義。

ICAM-1為免疫球蛋白家族中的一種表面黏附分子,其分布十分廣泛,包括上皮細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、單核巨噬細胞等。其主要功能為介導細胞間的黏附,促進炎癥細胞的遷移和趨化[9]。相關研究顯示,ICAM-1的異常表達參與了ALI發(fā)生發(fā)展和患者預后轉歸。該分子可以介導炎性細胞如中性粒細胞等與肺泡毛細血管上皮細胞聚集黏附,誘發(fā)炎癥反應,造成肺組織炎性損傷。一些細胞因子,如IL-1β、核轉錄因子κB等可促進ICAM-1的表達。近期實驗發(fā)現(xiàn),在A549細胞中,IL-1β可以增強ICAM-1啟動子與p65的結合力,從而上調ICAM-1 mRNA的表達[10-11]。本實驗發(fā)現(xiàn),布地奈德治療后,肺組織中IL-1β水平降低,進而肺組織中ICAM-1的表達減少,提示布地奈德可以減輕炎癥因子產生及炎癥因子遷移、趨化。

綜上所述,氣道給予布地奈德干預治療LPS誘導的ALI,其機制可能與抑制BALF中炎性因子生成、炎性細胞浸潤及趨化、改善肺水清除率有關。布地奈德對ALI的治療作用機制需要在臨床試驗中進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突