一貫煎對H2O2 誘導L02細胞DNA 氧化損傷的修復作用機制研究

王阿美 張 睿 劉文蘭

首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069

乙型肝炎病毒（HBV）感染可導致多種肝病，包括慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌（HCC）[1]。研究顯示[2-4]，各種肝病的發(fā)生、發(fā)展與氧化損傷密切相關(guān)，DNA 氧化損傷可能是肝病的共同發(fā)病機制。DNA 發(fā)生氧化損傷后，為了維持基因組的完整性和穩(wěn)定性，機體會啟動一系列DNA 損傷修復反應(yīng)，通過阻滯細胞周期對DNA 進行修復[5]。而一貫煎具有抗氧化能力，可保護細胞和組織免受活性氧的危害[6-8]。前期研究結(jié)果提示，一貫煎治療慢性肝損傷的藥理機制與抑制活性氧（ROS）從而減輕DNA 損傷有關(guān)，肝細胞氧化損傷產(chǎn)生大量ROS，與DNA 損傷也有密切關(guān)系，但具體機制尚不清楚。因此，探討一貫煎修復DNA 氧化損傷是否能夠提高人正常肝細胞抵御氧化損傷的能力，具有重要的科研意義和臨床價值。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物

人正常肝細胞（L02），第15 代，購自北京普京康利科技有限公司，品牌為keygen 凱基生物，批號為：KG063。雄性Sprague-Dawlay 大鼠40 只。體重180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0011，合格證號：114007 00375946。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物科學部20～25℃室溫、濕度50% SPF 級動物室。普食喂養(yǎng)，自由飲食。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學動物實驗及實驗動物福利委員會審批同意。倫理編號：AEEI-2018-036。

1.2 藥物及試劑

原方出自清代魏之繡著的《柳州醫(yī)話》，功用滋陰疏肝，主治肝腎陰虛，肝郁氣滯證[9-10]。于北京同仁堂藥店選購標準中藥材，北沙參9 g、麥冬9 g、當歸9 g、生地黃20 g、枸杞子12 g、川楝子4.5 g，將飲片置煎煮容器內(nèi)，加藥材量約6 倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，過濾并收集濾液。藥渣加3 倍量水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾并收集濾液，將2 次濾液合并為一貫煎濃縮液，待冷卻后裝入滅菌藥瓶中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

DMEM 培養(yǎng)基（Corning，10-013-crv），PBS（Corning，21-040-cvr），胎牛血清（Gibco，1932597），H2O2（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9311），Vc（Sigma，SLBN3833V），CCK-8 試劑盒（DOJINDO，LB622），細胞周期試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，20180712），活性氧檢測試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，C1300），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，L190603569），培養(yǎng)細胞/細菌總RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，RT411]，PrimeScript 1 st Strand cDNA Synthesis Kit [天根生化科技（北京）有限公司，KR116]，PrimeScript RT MasterMix Perfect Real Time Kit [天根生化科技（北京）有限公司，F(xiàn)P205]。

1.3 儀器

正置熒光顯微鏡（Lecia，Qwin）、高速離心機（Sigma，4-16KS 離心機，離心半徑10 cm）、低溫離心機（Heraeus，Biofuge15R，離心半徑10 cm）、酶標儀（Molecular Devices，SpectraMax iD3）、流式細胞儀（BD Biosciences，BD LSRFortessa 定制型流式儀）、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Applied Biosystems，Veriti96）等。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清的制備 大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組及陽性對照組，每組5 只。正常對照組和模型對照組、陽性對照組，每只大鼠每次灌服蒸餾水1 mL/100 g，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組分別給予成人生藥用量的2.5、5、10 倍熬制濃煎液1 mL/100 g，以上各組分別灌服2 次/d，間隔6 h，連續(xù)3 d。第3 天完成2 次給藥后，等待2 h，再次給藥1 h 后，對大鼠進行1%戊巴比妥鈉（0.6 mL/100 g）腹腔注射。麻醉后腹主動脈取血，室溫靜置2 h，以3000 r/min 速度，4℃下，離心20 min。吸取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，56℃水浴滅活30 min，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細胞培養(yǎng)與分組 將復蘇后的L02 細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長至指數(shù)期，按照1∶3 比例傳代，觀察細胞生長狀況，1～2 d 更換培養(yǎng)基。待細胞生長至狀態(tài)良好，將細胞隨機分為6 組，分別為正常對照組、模型對照組、一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組、陽性對照組，用不含血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，使細胞周期同步。正常對照組及模型對照組加入含有20%正常大鼠血清的培養(yǎng)基，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組、陽性對照組分別加入20%一貫煎小劑量含藥血清，20%一貫煎中劑量含藥血清、20%一貫煎大劑量含藥血清以及含有20%正常大鼠血清且Vc 終濃度為0.1 mmol/L的培養(yǎng)基，孵育24 h，PBS 洗2 遍，除正常對照組外，其余各組加入H2O2（0.6 mmol/L）。

1.4.3 H2O2誘導L02 細胞氧化損傷模型的建立 取對數(shù)期生長的L02 細胞，以5×103/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，隨機分為5 組，分別為正常對照組及4 個模型對照組，另設(shè)空白孔，每組3 個復孔?？瞻卓准罢φ战M每孔加入100 μL 無血清培養(yǎng)基，模型對照組分別加入H2O2濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的無血清培養(yǎng)液100 μL，分別孵育1、3 h 后，采用CCK-8 法，于1、3 h 時檢測OD 值，計算細胞存活率。細胞存活率=（OD模型對照組-OD空白孔）/（OD正常對照組-OD空白孔）。實驗重復3 次。

1.4.4 一貫煎對L02 細胞存活率的影響 取對數(shù)期生長的L02 細胞，以5×103/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，隨機分為6 組，分別為正常對照組、模型對照組、一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組、陽性對照組。接種到96 孔板中，設(shè)置3 個復孔，每孔加入100 μL 細胞懸液，待細胞貼壁融合至50%～60%，更換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。對各組細胞分別處理后，采用CCK-8法于酶標儀450 nm 處檢測OD 值，計算細胞存活率，實驗重復3 次，細胞存活率越高氧化損傷修復水平越高。

1.4.5 ELISA 檢測一貫煎對L02 細胞8-羥基脫氧鳥苷含量的影響 取對數(shù)期生長的L02 細胞，以1×105/孔密度接種于12 孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，隨機分組并對各組細胞分別進行處理后，按照ELISA 試劑盒說明書操作，每組分別加入50 μL細胞培養(yǎng)液上清后，立即加入50 μL 檢測溶液A，37℃孵育1 h；甩干，用PBS 洗板3 次；之后加100 μL檢測溶液B，37℃孵育30 min；用PBS 洗板5 次；加90 μL TMB 底物，37℃孵育15 min；加50 μL 終止液，立即于酶標儀下450 nm 讀數(shù)。實驗重復3 次。

1.4.6 流式細胞儀檢測一貫煎對L02 細胞內(nèi)ROS 含量的影響 取對數(shù)期生長的L02 細胞，以1×105/孔密度接種于12 孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，隨機分組并對各組細胞分別處理后，加入濃度為10 uM 的DCFH-DA 探針，37℃避光孵育30 min，PBS沖洗2 次，后消化并收集，1000 r/min 離心5 min，去上清。加入500 μL PBS 立即上機進行ROS 檢測并統(tǒng)計平均熒光強度。實驗重復3 次。

1.4.7 流式細胞儀檢測一貫煎對L02 細胞周期影響取指數(shù)期生長良好的L02 細胞，以2×105/孔密度接種于6 孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，隨機分組并對各組細胞分別處理后，消化并收集。1200 r/min 離心6 min，去上清，用預(yù)冷的80 %乙醇將細胞懸浮處理，4℃固定過夜。PBS 沖洗2 次，離心去上清，加入500 μL 樣品染色液（450 μL PI+50 μL RNA 酶），37℃避光孵育30 min。進行細胞周期檢測并計算各期細胞百分率。實驗重復3 次。

1.4.8 實時熒光定量PCR 檢測一貫煎對L02 細胞中ATM、CHK2、Cdc25A、Cdc25C mRNA 表達的影響 取對數(shù)期生長的L02 細胞，以2×105/孔密度接種于6 孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，隨機分組并對各組細胞分別處理后，后消化并收集，1000 r/min 離心5 min，去上清。先提取L02 細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 模板后，進行Real Time PCR。實驗重復3 次。引物序列分別為β-actin 上游：3′-TCCTTCCGCAGCTATTTATGAT-5′，β-actin 下游：3′-CACAGTATAGGATGGTCTGGAC-5′；ATM 上 游：3′-ATCTGCTGCCGTCAACTAGAA-5′，ATM 下游：3′-GATCTCGAATCAGGCGCTTAAA-5′；CHK2 上 游：3′-TTATCTGCCTTAGTGGGTATCCA-5′，CHK2 下游：3′-CTGTCGTAAAACGTGCCTTTG-5′；Cdc25A 上 游：3′-TTCCTCTTTTTACACCCCAGTCA-5′，Cdc25A 下游：3′-TCGGTTGTCAAGGTTTGTAGTTC-5′；Cdc25C 上游：3′-ATGACAATGGAAACTTGGTGGAC-5′，Cdc25C 下游：3′-GGAGCGATATAGGCCACTTCTG-5′。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett-T3 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2對L02 細胞細胞活力的影響

0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L H2O2對L02 細胞生長增殖均有抑制作用，H2O2濃度越高，作用時間越長，OD 值越低，細胞存活率越低。其中，當H2O2濃度為0.6 mmol/L，作用時間為1 h 時，存活率約為61%。相同濃度下，3 h 存活率低于1 h。H2O2易分解，將H2O2濃度為0.6 mmol/L，培養(yǎng)細胞時間為1 h 作為建立穩(wěn)定有效的人正常肝細胞氧化應(yīng)激損傷模型的的處理方式。見表1。

表1 不同濃度H2O2對L02 細胞細胞活力影響（，n=9）

表1 不同濃度H2O2對L02 細胞細胞活力影響（，n=9）

注：與同時間點正常對照組比較，*P ＜0.01

2.2 一貫煎對L02 細胞存活率的影響

與正常對照組比較，模型對照組OD 值及細胞存活率顯著降低（P ＜0.05）。與模型對照組比較，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組及陽性對照組OD 值及細胞存活率均顯著升高（P ＜0.05），其中一貫煎中劑量組OD 值及細胞存活率升高最明顯，細胞存活率約為90.19%。見表2。

表2 一貫煎對L02 細胞存活率的影響（，n=9）

表2 一貫煎對L02 細胞存活率的影響（，n=9）

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與模型對照組比較，bP ＜0.05

2.3 一貫煎對L02 細胞8-OHDG 含量的影響

與正常對照組比較，模型對照組8-OHDG 含量顯著升高（P ＜0.05）。與模型對照組比較，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組及陽性對照組8-OHDG 含量均顯著降低（P ＜0.05），其中一貫煎中劑量組8-OHDG 含量降低最明顯。見圖1。

圖1 一貫煎對L02 細胞8-OHDG 含量的影響

2.4 一貫煎對L02 細胞ROS 含量的影響

與正常對照組比較，模型對照組ROS 平均熒光強度顯著增高（P ＜0.05）。與模型對照組比較，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組及陽性對照組ROS 平均熒光強度顯著下降（P ＜0.05），其中一貫煎中劑量組ROS 平均熒光強度下降最明顯。見圖2。

2.5 一貫煎對L02 細胞周期的影響

與正常對照組比較，模型對照組G1期細胞百分率顯著減少（P ＜0.05），S 期及G2/M 期細胞百分率均顯著增加（P ＜0.05）。與模型對照組比較，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組及陽性對照組在G1期細胞百分率均顯著增加（P ＜0.05），而S 期和G2/M 期細胞百分率均顯著減少（P ＜0.05）。見圖3、表3。

2.6 一貫煎對L02 細胞ATM、CHK2、Cdc25A、Cdc25C的mRNA 表達影響

與正常對照組比較，模型對照組ATM、CHK2 的mRNA 表達顯著上調(diào)（P ＜0.05），Cdc25A、Cdc25C 的mRNA 表達顯著下調(diào)（P ＜0.05）。與模型對照組比較，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組及陽性對照組ATM、CHK2 的mRNA 表達顯著下調(diào)（P ＜0.05），Cdc25A、Cdc25C 的mRNA 表達顯著上調(diào)（P ＜0.05）。見圖4。

3 討論

圖2 一貫煎對L02 細胞內(nèi)ROS 含量影響

圖3 一貫煎對L02 細胞周期的影響

表3 一貫煎對L02 細胞周期百分比影響（，n=3）

表3 一貫煎對L02 細胞周期百分比影響（，n=3）

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與模型對照組比較，bP ＜0.05

ROS 包括自由基（如羥基自由基）和非自由基（如過氧化氫），是正常細胞代謝特別是線粒體代謝產(chǎn)生的高度反應(yīng)性副產(chǎn)物。一般來說，適當?shù)腞OS 生成可能對許多細胞功能至關(guān)重要，但在生產(chǎn)過剩的情況下對生物體有害[11]。大量研究顯示，隨著ROS 的過度累積，進一步引起包括DNA 鏈斷裂、DNA 位點突變等多種形式的DNA 損傷[12]。其中，8-OHdG 是氧自由基誘導的DNA 突變產(chǎn)物，一般用來反映DNA 損傷程度[13-15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16]，CHB 患者肝細胞內(nèi)8-OHdG 數(shù)量與肝臟病理損傷呈正相關(guān)。一旦發(fā)生DNA 氧化損傷，機體會立即啟動一系列DNA 損傷修復（DDR）通路。當細胞累計DNA 氧化損傷超過一定程度，超出自身負荷時，DNA 修復速度下降，一方面，出現(xiàn)DNA 復制突變的基因，使細胞分裂失控，最終引起癌變；另一方面，可能引起細胞自噬或凋亡[17-19]。

圖4 一貫煎對L02 細胞ATM、CHK2、Cdc25A、Cdc25C 的mRNA 表達影響

一般情況下DNA 損傷的修復有賴于細胞周期檢測點信號通路。ATM 蛋白激酶依賴性信號轉(zhuǎn)導通路參與細胞周期多個檢測點的調(diào)控[20]。其中，CHK2 是生物進化過程中非常保守的蛋白激酶，ATM 被激活后，進一步活化CHK2，引起Cdc25 磷酸化并失活，從而導致細胞周期阻滯。當細胞內(nèi)ROS 過度累積時，細胞發(fā)生DNA 氧化損傷，ATM 被激活，機體立即對DNA進行修復。其中，ATM 可通過激活下游細胞周期檢查點蛋白CHK2 等，CHK2 磷酸化，多聚泛素化介導的蛋白降解途徑導致Cdc25A/Cdc25C 降解，使細胞周期無法繼續(xù)，暫時性地引起S 期及G2/M 期阻滯，以便為DNA 修復提供足夠的時間[21]。

目前，H2O2是細胞DNA 氧化損傷較常選用的造模藥物。H2O2作用時間越久越有可能造成不可逆性損傷，導致藥物不能起到修復作用。本實驗為避免造成L02 細胞不可逆性損傷，以IC50（半數(shù)抑制率）作為造模藥物毒性濃度的篩選標準。同時既往研究顯示[22]，以細胞活性下降后達到或接近60%作為判斷L02 細胞氧化損傷模型建立成功的標準。綜上所述，最終選擇H2O2濃度為0.6 mmol/L，作用1 h 為造模濃度。與正常對照組比較，模型對照組L02 細胞8-OHDG 含量顯著增加（P ＜0.05），ROS 平均熒光強度顯著增加（P ＜0.05），提示H2O2誘導L02 細胞DNA 氧化損傷模型成功。與模型對照組比較，一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組干預(yù)后，細胞存活率顯著升高（P ＜0.05）；L02 細胞ROS 平均熒光強度顯著減少（P ＜0.05），且8-OHDG 含量顯著下降（P ＜0.05），提示一貫煎含藥血清對L02 細胞DNA 氧化損傷減輕明顯，從而起到修復DNA 氧化損傷的作用。一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組G1期細胞比例增加，S 期細胞減少，G2/M 期細胞比例減少（P ＜0.05），提示一貫煎含藥血清使L02 細胞DNA 氧化損傷減輕，使L02 細胞阻滯在G1期，抑制H2O2對L02細胞S 期及G2/M 期的阻滯，減緩細胞DNA合成、分裂，為細胞DNA 損傷修復延長時間。一貫煎小劑量組、一貫煎中劑量組、一貫煎大劑量組ATM、CHK2 的mRNA 表達下調(diào)，Cdc25A、Cdc25C mRNA 表達上調(diào)（P ＜0.05），提示一貫煎含藥血清通過抑制ATM/CHK2/Cdc25A/Cdc25C 信號通路修復L02 細胞DNA 氧化損傷。本研究一貫煎中劑量組較一貫煎小劑量組和一貫煎大劑量組作用明顯，考慮一貫煎中劑量組已經(jīng)達到最佳藥效，再加大劑量，副作用增加，總療效則下降。因此，開發(fā)出干預(yù)ATM/CHK2/Cdc25A/Cdc25C 信號通路的的新藥物，對于臨床慢性乙型病毒型肝炎患者，阻止向肝硬化及肝癌進展，具有積極意義。