石榴果皮中類黃酮的超聲輔助提取及抗自由基檢測

樊琛 曾慶華 李燕 王會 孫小凡 梁榮 郭興峰 鄭煥芹 馮成成

摘要：為了探討石榴果皮廢物資源化利用及其類黃酮抗自由基能力，以石榴果皮為原料，探討超聲次數(shù)、提取時間、溫度、料液比及乙醇體積分?jǐn)?shù)對石榴果皮中類黃酮提取效果的影響。NKA-2大孔樹脂純化類黃酮提取物，以IC50為指標(biāo)檢測純化物清除羥自由基、超氧自由基、2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）及1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）的能力，并與維生素C抗自由基能力比較。結(jié)果表明，石榴果皮提取類黃酮的最佳條件為超聲10次，持續(xù)時間5 s/次，浸提溫度65 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)35%，浸提時間4 h，料液比1 g ∶ 60 mL，類黃酮提取量為21.34 mg/g。類黃酮純化物清除上述4種自由基的IC50分別為1.22 mg/mL、0.061 mg/mL、0.16 mg/mL、1.37 μg/mL，與維生素C的IC50（0.87 mg/mL、0.094 mg/mL、0.07 mg/mL、2.88 μg/mL）接近。由此可見，石榴果皮可作為類黃酮提取原料，提高石榴果皮廢物資源化利用。

關(guān)鍵詞：石榴果皮;類黃酮;自由基

中圖分類號： R282 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0200-04

石榴是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的果實，在山東、江蘇、河南等地皆有種植，其果實營養(yǎng)豐富。研究表明，石榴汁或其提取物能夠有效清除多種自由基，對動脈粥樣硬化、腫瘤、糖尿病、細(xì)菌感染等均具有一定的防治作用[1-3]。但石榴果皮（包括外果皮、中果皮、內(nèi)果皮）作為廢棄物，浪費較大。石榴果皮厚2～4 mm，質(zhì)量占45%～48%。石榴果皮主要活性成分有鞣質(zhì)、類黃酮、有機(jī)酸及生物堿等[3]。石榴果皮中的類黃酮化合物具有抗氧化活性[3-6]。因此，本試驗以石榴果皮為材料，采用單因素試驗與L9（34）正交試驗，探討石榴果皮中類黃酮提取工藝，并以NKA-2型大孔樹脂純化粗提物提取量，檢測石榴果皮類黃酮純化物抗羥自由基（·OH）、超氧自由基、2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）和1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）的能力，旨在提高石榴果皮中類黃酮的提取量，并為類黃酮的提取和石榴產(chǎn)業(yè)深開發(fā)提供新的途徑，實現(xiàn)廢物資源化利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 新鮮、完整的石榴，2018年10月購于山東聊城當(dāng)?shù)厥袌?。于聊城大學(xué)食品科學(xué)實驗室去除石榴籽后，55 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎過篩。

1.1.2 試驗試劑 無水乙醇、鹽酸、水楊酸、EDTA、硫酸亞鐵、Tris、鄰苯三酚、2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、濃硫酸等，均為分析純。

1.1.3 試驗儀器 UV-1800型紫外可見分光光度計，購自上海美譜達(dá)儀器有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，購自寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 類黃酮的測定 以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)樣品，絡(luò)合-分光光度計法測定類黃酮含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4-7]。準(zhǔn)確吸取 0.5 mL 提取液并稀釋至 5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算樣液的類黃酮含量[4-7]。

1.2.2 各因素對類黃酮提取量的影響 （1）超聲次數(shù)。稱取0.4 g石榴皮粉末，在料液比1 g ∶ 40 mL、60%乙醇條件下分別超聲（150 W）5、10、20、30、40次，持續(xù)時間5 s/次，40 ℃提取3 h，過濾定容至 25 mL，測定類黃酮含量。

（2）料液比。量取60%乙醇溶液20 mL，按料液比1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 60 mL加入樣品，超聲10次后 40 ℃ 提取3 h，過濾定容至 25 mL，測定類黃酮含量。

（3）乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取0.4 g樣品，按料液比1 g ∶ 40 mL分別加入0、15%、30%、45%、60%、75%、90%乙醇，超聲10次后40 ℃提取3 h，過濾定容至25 mL，測定類黃酮含量。

（4）提取時間。稱取0.4 g樣品，料液比 1 g ∶ 40 mL 加入60%乙醇，超聲10次后40 ℃分別提取20 min、1 h、3 h、6 h、12 h、18 h，過濾定容至 25 mL，測定類黃酮含量。

（5）提取溫度。稱取0.4 g樣品，按料液比 1 g ∶ 40 mL 加入60%乙醇水溶液，超聲10次后分別在30、40、50、60、80 ℃下浸提3 h，過濾定容至 25 mL，測定類黃酮含量。

（6）正交試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間的L9（34）正交試驗，以提取液類黃酮含量為指標(biāo)，確定提取石榴果皮類黃酮的最佳工藝[4-7]。

1.2.3 類黃酮的純化 經(jīng)預(yù)處理的NKA-2型大孔樹脂靜態(tài)分離純化石榴皮類黃酮，45 ℃恒溫振蕩 21 h吸附，60%乙醇于 25 ℃恒溫振蕩24 h解吸附，獲得石榴果皮類黃酮純化液[8-9]。

1.2.4 抗自由基檢測 （1）抗羥自由基。0.4 mL 0.15 mol/L FeSO4、2.0 mL 2 mmol/L水楊酸、1.0 mL 6 mmol/L H2O2以及樣液1.0 mL;對照以蒸餾水代替樣液。加入H2O2后37 ℃水浴1 h，測 510 nm 處的吸光度，計算清除率[6，10]。

式中：D1為試驗組吸光度;D0為對照組吸光度。

（2）抗超氧陰離子自由基。A液：pH值為8.20的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液。B液：4.5 mmol/L 鄰苯三酚鹽酸溶液。25 ℃依次加入A液2.35 mL、1.00 mL蒸餾水、1.00 mL樣液及 0.15 mL B液于比色管中，立刻測定325 nm初始吸光度，1 min后再次測定吸光度。對照以蒸餾水代替樣液。計算清除率[11-12]。

式中：ΔD0為對照組吸光度差值;ΔD1為試驗組吸光度差值。

（3）抗ABTS自由基。待測液2 mL加入7 mL ABTS標(biāo)準(zhǔn)工作液振蕩搖勻，常溫避光10 min后測吸光度D1。同時做對照測吸光度D0，計算清除率[13]。

式中：D1為試驗組吸光度;D0為對照組吸光度。

（4）抗DPPH自由基。待測液2 mL加入2 mL DPPH溶液振蕩搖勻，密封避光30 min，517 nm測吸光度D1。同時做對照測吸光度D0，計算清除率[13-15]。

式中：D1為試驗組吸光度;D0為對照組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

類黃酮提取優(yōu)化結(jié)果以正交設(shè)計助手v3.1分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，回歸方程：y=12.617x+0.009 6，r2=0.998 1。式中：y為吸光度;x為質(zhì)量體積濃度，mg/mL。

2.2 不同因素對石榴果皮類黃酮提取量的影響

2.2.1 超聲次數(shù)的影響 由圖2可知，隨超聲次數(shù)增加，石榴果皮中類黃酮提取量先增加后降低。超聲次數(shù)為10次時，提取量最高。超聲時間過長可能會破壞類黃酮，因此后續(xù)試驗均采用超聲10次，持續(xù)時間5 s/次。

2.2.2 料液比的影響 由圖3可知，類黃酮提取量隨溶劑的比例增大而增高，但在1 g ∶ 60 mL之后增高不明顯，考慮節(jié)省成本，選擇料液比為1 g ∶ 50 mL～1 g ∶ 70 mL 進(jìn)行正交試驗。

2.2.3 浸提時間的影響 由圖4可知，類黃酮的提取量隨浸提時間的延長先升高后下降，3 h時最高。由此推測，浸提時間過長，導(dǎo)致部分類黃酮分解。因此，選擇2～4 h進(jìn)行正交試驗。

2.2.4 浸提溫度的影響 由圖5可知，隨浸提溫度增加，類黃酮提取量先增加后降低。當(dāng)浸提溫度為60 ℃時，類黃酮提取量最高。提高浸提溫度有助于類黃酮物質(zhì)溶出，但溫度過高可能破壞類黃酮結(jié)構(gòu)，且對溶劑極性有影響，因此選擇55～65 ℃進(jìn)行正交試驗。

2.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 由圖6可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，類黃酮提取量先增加后降低，在30%時達(dá)到最高。因此選擇25%～35%乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行正交試驗。

2.3 正交試驗及驗證結(jié)果

采用L9（34）正交試驗確定石榴果皮中類黃酮的最佳提取工藝。由表1可知，4個因素對石榴果皮類黃酮提取影響的強(qiáng)弱依次為浸提溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提時間>料液比，根據(jù)均值確定最佳提取工藝為C3A3D3B2，即最優(yōu)提取條件為浸提溫度65 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、浸提時間4 h、料液比 1 g ∶ 60 mL。經(jīng)驗證試驗，在此條件下，類黃酮提取量平均值為21.34 mg/g，優(yōu)于正交試驗中所有組合。

2.4 石榴果皮類黃酮對4種自由基的清除能力

將NKA-2型大孔樹脂純化的類黃酮溶液及維生素C溶液分別逐級稀釋，測定其對·OH、超氧自由基、ABTS+·、DPPH·的清除能力，計算自由基清除IC50。類黃酮純化物與維生素C抗自由基IC50比較，見表2。

由表2可知，石榴果皮中類黃酮純化物對羥自由基、超氧自由基、ABTS+·、DPPH·均具有清除能力。其中，類黃酮純化物對羥自由基、ABTS+·的清除能力略小于維生素C，純化物對超氧自由基、DPPH·的清除能力略強(qiáng)于維生素C。但總體而言，石榴果皮中類黃酮純化物的抗自由基與強(qiáng)抗氧化劑維生素C十分接近。石榴果皮類黃酮純化物對4種自由基的清除能力大小依次為DPPH·、 O-2 · ?、ABTS+·、·OH。

3 討論與結(jié)論

宋薇薇在對石榴外果皮總黃酮的提取試驗中采用乙醇提取微波輔助法，得出最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、微波功率140 W、提取時間60 s、料液比1 g ∶ 15 mL，此時總黃酮得率為（6.64±0.032）%[3]。本試驗選用超聲輔助提取，試驗材料石榴果皮選用的是外果皮和中果皮，最佳提取條件下的類黃酮提取量為21.34 mg/g。獲得的類黃酮提取效率低于宋薇薇微波輔助法的提取效率。植物因不同品種、不同產(chǎn)地、不同部位，其生理活性物質(zhì)含量有所差異。由此推測，不同輔助預(yù)處理方式、石榴的產(chǎn)地、品種、選用部位等均會對石榴皮中類黃酮含量及類黃酮提取效率產(chǎn)生影響。石榴果皮全果皮或僅選用外果皮，類黃酮含量有差異，外果皮的類黃酮含量通常高于中果皮。本試驗選用的材料包含外果皮和中果皮，有資料顯示，不同石榴品種、不同部位對類黃酮提取物抗自由基能力存在差別。如云南玉溪產(chǎn)地的酸石榴其 DPPH·清除率的IC50 可達(dá)到0.005 mg/mL。本試驗中采用山東聊城產(chǎn)的石榴，其類黃酮純化物清除DPPH·的IC50為 1.37 μg/mL，略強(qiáng)于云南玉溪產(chǎn)石榴。本試驗檢測了石榴果皮類黃酮對4種自由基的清除能力，石榴果皮的類黃酮純化物對羥自由基、超氧自由基、ABTS+·、DPPH·均具有清除能力，且與強(qiáng)抗氧化劑維生素C十分接近。筆者曾檢測玫瑰花苞浸出液的抗自由基能力，結(jié)果表明玫瑰花苞浸出液對 DPPH·、ABTS+·的清除能力較強(qiáng)，對羥基自由基的清除能力較弱，這與本試驗中石榴果皮類黃酮清除幾種自由基的能力相似。本試驗發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)大孔樹脂純化的類黃酮粗提液也具有清除自由基能力。石榴果皮粗提液中含有生物堿、多酚等多種成分。粗提液對羥自由基、ABTS+·、DPPH·的清除能力高于純化液，但對超氧自由基的清除能力低于純化液。這可能是由于不同物質(zhì)對各種自由基的效應(yīng)不同。

本試驗采用石榴果皮（包括外果皮、中果皮）提取類黃酮，最佳條件為超聲10次（持續(xù)時間 5 s/次）、浸提溫度65 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、浸提時間4 h、料液比 1 g ∶ 60 mL，類黃酮提取量為21.34 mg/g。類黃酮純化物清除羥自由基、超氧自由基、ABTS+·和DPPH·的IC50分別為1.22 mg/mL、0.061 mg/mL、0.16 mg/mL、1.37 μg/mL，與維生素C的IC50（0.87 mg/mL、0.094 mg/mL、0.07 mg/mL、2.88 μg/mL）接近。這為石榴果皮作為類黃酮提取原料、提高石榴果皮廢物資源化利用提供了試驗依據(jù)。