大蒜精油提取、成分分析及其抑菌效果

蔡錦玲 陳品品 藍(lán)波妙 林濤

摘要：大蒜除了含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有良好的藥用功效，提取出的大蒜精油對(duì)人體、作物和環(huán)境安全。通過分析4種不同大蒜品種的出油量，氣相色譜-質(zhì)譜法分析大蒜精油的成分和抑菌成分的相對(duì)含量，并利用體外直接接觸的方式研究對(duì)粉紅單端孢菌、鏈格孢菌、灰葡萄孢菌、意大利青霉和匍枝根霉菌的抑菌效果。結(jié)果表明：不同品種的出油量存在顯著差異，白皮大蒜出油量約為紫白皮大蒜出油量的4倍;大蒜精油成分分析中，50%的成分具有抑菌作用;在對(duì)5種病原菌的抑菌試驗(yàn)中，大蒜精油均表現(xiàn)出良好抑菌效果，抑制效果為粉紅單端孢菌>鏈格孢菌>灰葡萄孢菌>意大利青霉>匍枝根霉菌。由此可見，大蒜精油具有良好的抑菌作用，能夠用于果蔬采后保鮮中。

關(guān)鍵詞：大蒜精油;出油量;氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）;抑菌;保鮮

中圖分類號(hào)： TS201 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0186-04

大蒜（Allium sativum L.）屬于百合科蔥屬，起源于亞歐大陸的中南部地區(qū)，目前全球范圍均有種植[1]。大蒜的地下鱗莖包含的化學(xué)成分復(fù)雜，如氨基酸、維生素、脂肪、微量元素及硫化合物等，不但是日常飲食中不可或缺的調(diào)味食材，還具有抑菌、保健抗癌和提高免疫力等作用[2-4]。

大蒜精油是大蒜中一種特殊呈明亮琥珀色的天然液體提取物，其中活性硫化物為主要成分，為大蒜成分總含量的0.3%左右，對(duì)不同類型的病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果[5]。蠟樣芽孢桿菌是一種在自然界中廣泛存在的細(xì)菌，特別容易感染各類食品。穆可云等的研究表明，0.01%濃度的大蒜精油對(duì)3種不同的蠟樣芽孢桿菌均有不錯(cuò)的抑菌作用[6]。對(duì)鏈格孢霉和青霉的抑菌研究中，大蒜精油不僅在單獨(dú)使用時(shí)起到抑制作用，并且與肉桂精油復(fù)配時(shí)同樣具有很好的抑菌作用[7]。黃笠原等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的大蒜精油，在純菌培養(yǎng)和熏馬腸發(fā)酵過程的抑菌試驗(yàn)中，均能表現(xiàn)出顯著的抑菌效果[8]。但是，大蒜精油在果蔬采后病原菌上的抑制效果尚不明確，并且對(duì)不同病原菌在體外直接接觸抑菌效果的差異有待研究。

目前，大蒜精油可通過水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法、分子蒸餾法等方法提取，不同的提取方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)[9]。而水蒸氣蒸餾法利用混合物中不同成分的蒸汽壓力不同進(jìn)行分離，不僅對(duì)儀器設(shè)備和操作要求簡(jiǎn)單，而且具有出油量高和試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛。因此，本試驗(yàn)將通過水蒸氣蒸餾法提取大蒜精油。

本研究采用水蒸氣蒸餾法，以4個(gè)不同品種大蒜為原料進(jìn)行精油的提取，然后通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）儀分析大蒜精油的化學(xué)組成成分;并采用抑菌圈方法研究大蒜精油對(duì)5種果蔬采后主要病原菌（包括灰葡萄孢菌、鏈格孢菌、意大利青霉、匍枝根霉菌和粉紅單端孢菌）的抑菌活性，測(cè)定其抑菌效果指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同品種大蒜出油量存在顯著差異，白皮大蒜出油量最高，并且大蒜精油對(duì)供試的5種不同病原菌均存在抑制效果，其抑制效果為粉紅單端孢菌>鏈格孢菌>灰葡萄孢菌>意大利青霉>匍枝根霉菌。本研究的結(jié)果為大蒜精油在食品和病蟲害防治領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)的菌種培養(yǎng)、精油抑菌試驗(yàn)和精油 GC-MS 成分分析均于2019年在福建省泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所內(nèi)完成，大蒜精油的提取于2019年在福建省泉州市國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園內(nèi)完成。

1.2 材料與儀器

4個(gè)不同的大蒜品種均購自晉江市橋南農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)?；移咸焰呔?、鏈格孢菌、意大利青霉、匍枝根霉菌和粉紅單端孢菌均從上海保藏生物技術(shù)中心購買。吐溫20（購于北京索萊寶科技有限公司），PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基（購于杭州百思生物技術(shù)有限公司）。

植物精油提取機(jī)組（30 L）為上海矩源機(jī)械設(shè)備有限公司生產(chǎn);Agilent 7890B/5977 GCMSD氣質(zhì)聯(lián)用儀為安捷倫科技有限公司生產(chǎn);立式壓力蒸汽滅菌器HVE-50是廣州華粵行儀器有限公司生產(chǎn);SW-CJ-2D雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)為蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn);生化培養(yǎng)箱SPX-150BE是邦西儀器科技（上海）有限公司生產(chǎn)。

1.3 病原菌培養(yǎng)

超凈工作臺(tái)上挑取適量霉菌孢子劃線接種至PDA培養(yǎng)基并置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1周后，挑取適量孢子于無菌水中形成濃度約為105 個(gè)/mL的孢子懸浮液。分別取100 μL懸浮液于PDA培養(yǎng)基上涂布均勻，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后備用（圖 1）。

1.4 精油提取

大蒜精油通過水蒸氣蒸餾法提取，參照陳品品等的方法[10]并稍加修改。取試驗(yàn)材料3.0 kg，剪碎，放入精油提取器中，設(shè)置蒸餾溫度105 ℃、鍋爐溫度110 ℃、蒸餾時(shí)間3～6 h。等其沸騰時(shí)蒸餾出的揮發(fā)油較多，呈現(xiàn)黃色油液，有的油珠浮在液面，有的下沉略顯白色，下沉的油珠隨時(shí)放出。分出油層后，室溫下混合液靜置冷卻4 h以上。收集精油并測(cè)量記錄精油體積（mL）。精油出油量參照公式（1）計(jì)算：

1.5 GC-MS成分分析

色譜條件設(shè)定：色譜柱為HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度為230 ℃;載氣為高純氦氣（99.999%）;恒流模式：流速0.8 mL/min;分流比：50 ∶ 1;進(jìn)樣量1.0 μL。程序升溫條件設(shè)定：初始溫度45 ℃，持續(xù)3 min，然后設(shè)置3 ℃/min的速率將溫度提高到280 ℃，持續(xù) 5 min。

質(zhì)譜條件設(shè)定：電轟擊電離（EI），電子能量設(shè)定值為70 eV，離子源溫度設(shè)定值為250 ℃，接口溫度設(shè)定值為260 ℃，溶劑延遲設(shè)定值為4.0 min，掃描范圍設(shè)定值為50～600 m/z。

采集模式為SCAN掃描，各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫比對(duì)，通過波峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。

1.6 直接接觸抑制試驗(yàn)

將大蒜精油溶液溶于0.2%的乳化劑中充分乳化后，分別于50 ℃左右將其加入溶化好的培養(yǎng)基中充分混勻，設(shè)置7個(gè)不同的濃度水平，分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL/mL。將不同的處理和對(duì)照倒平板，用無菌打孔器在培養(yǎng)1周的病原菌平板上取直徑6 mm的菌斑，轉(zhuǎn)移到平板的中央，置于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于4 d后測(cè)量菌斑直徑。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并按照公式（2）計(jì)算期抑菌率：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大蒜品種的出油量比較

采用水蒸氣蒸餾法對(duì)4個(gè)不同的大蒜品種提取其精油成分，并計(jì)算不同品種的出油量（表1），不同大蒜品種的出油量存在明顯的差異，其中：白皮大蒜出油量最高，為0.53 mL/kg，紫白皮大蒜出油量最低，僅為0.13 mL/kg，而紫皮大蒜和紫皮獨(dú)頭蒜介于兩者之間，分別為0.40、0.27 mL/kg。由于其他大蒜品種的出油量低，不滿足后續(xù)試驗(yàn)的分析需求，本文僅分析白皮大蒜精油的成分組成及其抑菌效果，如無特別說明，下文提到的大蒜精油均指白皮大蒜提取的精油。

2.2 大蒜精油GC-MS分析

大蒜精油使用毛細(xì)管氣相色譜法進(jìn)行鑒定分析，通過氣相色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行比較，精油各組分的相對(duì)百分含量通過面積歸一化法計(jì)算得到。按上述的GC-MS條件對(duì)大蒜精油進(jìn)行分析，得到其總離子流圖（圖 2），共分離出23個(gè)峰，通過對(duì)主要色譜峰的鑒定分析，共鑒定出21種化合物成分（表2），其含量占色譜總流出峰相對(duì)百分含量的99.33%，其中：硫醚類占91.49%，而烯烴、酚醇、羧酸及酯類占6.05%，其他占1.79%。已鑒別出的21種化合物中主要抗菌成分為二烯丙基三硫醚，相對(duì)含量占29.29%;其次為烯丙基二硫，含有19.88%;（+）-檸檬烯含有0.65%，占已鑒別出的化學(xué)成分總含量的51.41%。

2.3 直接接觸抑制效果的比較

比較大蒜精油在5種果蔬采后主要病原菌（鏈格孢菌、灰葡萄孢菌、意大利青霉、粉紅單端孢菌和匍枝根霉菌）上的抑菌效果。不同濃度的大蒜精油對(duì)引起果蔬采后病害的5種病原菌具有不同程度的抑制作用，并且隨著精油濃度的不斷提高，抑制效果呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)（圖 3）。在精油濃度達(dá)到0.1 μL/mL時(shí)，對(duì)灰葡萄孢菌和粉紅單孢菌的抑制率達(dá)到70%以上;升至0.2 μL/mL時(shí)，對(duì)粉紅單孢菌的抑制率達(dá)到100%，為該菌大蒜精油的最小抑菌濃度MIC，其次對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率在87%以上;在濃度為0.3 μL/mL時(shí)，對(duì)鏈格孢菌的抑制率達(dá)到100%，為該菌大蒜精油的最小抑菌濃度;在濃度為0.4 μL/mL時(shí)，對(duì)意大利青霉和灰葡萄孢菌的抑制率均達(dá)到85%以上;在濃度為0.5 μL/mL時(shí)，對(duì)灰葡萄孢菌的抑制率達(dá)到100%，為該菌的最小抑菌濃度;當(dāng)大蒜精油濃度達(dá)到0.6 μL/mL時(shí)，對(duì)意大利青霉的抑制率達(dá)到100 %，為該菌的最小抑菌濃度;大蒜精油對(duì)匍枝根霉菌的抑制能力較其他4種菌種差，當(dāng)大蒜精油濃度為0.7 μL/mL時(shí)，抑制率為65.63%。

3 結(jié)論與討論

大蒜的出油量與品種相關(guān)，不同品種的出油量相差較大，白皮大蒜出油量約為紫白皮大蒜出油量的4倍，為0.53 mL/kg。利用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)提取的白皮大蒜精油進(jìn)行成分分析鑒定，得到大蒜精油中有21種組分，分別含有醚、烯、醇和酯類等化合物，其中主要抗菌成分包括二烯丙基三硫醚（29.29%）、烯丙基二硫（19.88%）、（+）-檸檬烯（0.65%）。大蒜精油對(duì)粉紅單端孢菌、鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的抑菌效果良好，尤其對(duì)粉紅單端孢菌具有顯著的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.2 μL/mL，而鏈格孢菌和灰葡萄孢菌分別在0.3、0.5 μL/mL時(shí)達(dá)到最小抑菌濃度。大蒜精油對(duì)匍枝根霉菌的抑制能力較其他4種菌種差，當(dāng)大蒜精油濃度為0.7 μL/mL時(shí)，抑制率也不能達(dá)到100%。抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜精油對(duì)果蔬采后病菌抑制效果為粉紅單端孢菌>鏈格孢菌>灰葡萄孢菌>意大利青霉>匍枝根霉菌。

大蒜除了含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有良好的藥用功效，提取出的大蒜精油對(duì)人體、作物和環(huán)境安全，具有“天然抗生素”的美名。雖然可以通過不同的技術(shù)和工藝提高大蒜精油的出油率[9]，但是不同品種提取的精油量尚不明確。通過比較大蒜不同品種在水蒸氣蒸餾法下的出油量，本研究發(fā)現(xiàn)品種差異也是導(dǎo)致精油提取量的重要原因，出油量最大能相差到4倍。因此，在改進(jìn)提取工藝的同時(shí)，培育精油含量高的品種也是提高出油率的一個(gè)重要研究方向。

大蒜精油中具有抑菌效果的成分占了總含量的50%以上，是其具有廣譜抑菌能力的保證。通過比較大蒜精油對(duì)5種不同的果蔬采后病原菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)大蒜對(duì)所有病原菌均具有抑制效果，抑制效果依次為粉紅單端孢菌>鏈格孢菌>灰葡萄孢菌>意大利青霉>匍枝根霉菌。在粉紅單端孢菌、鏈格孢菌、灰葡萄孢菌和意大利青霉試驗(yàn)中，提高大蒜精油濃度水平均能達(dá)到100%的抑菌效果，而匍枝根霉菌濃度為0.7 μL/mL時(shí)抑制效果為65.63%，未能達(dá)到100%的抑菌效果。依據(jù)試驗(yàn)的結(jié)果，可通過提高大蒜精油的濃度來達(dá)到匍枝根霉菌的最小抑菌濃度。但是，大蒜精油具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，會(huì)對(duì)人體粘膜產(chǎn)生較強(qiáng)刺激，這些因素極大地限制了大蒜精油直接在果蔬采后保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用。而通過組合不同的植物精油，配制復(fù)方精油[7]，不但可以同時(shí)利用不同精油在不同病原菌的抑菌能力，而且通過添加具有芬芳?xì)馕兜木?，可以中和大蒜精油中的刺激氣味，直接?yīng)用于采后果蔬的保鮮中。

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