5種栽培茄與赤茄雜交親和性分析及雜交種鑒定

薛金燕 吳雋香 劉益勇 徐照璨 趙恩鵬 張杰 成玉富 楊旭

摘要：以L106、L108、L51、L171、L81為母本，赤茄（Solanum integrifolium Pro.）為父本，采用重復授粉、花柱短截及混合授粉3種授粉方式進行雜交，利用熒光顯微鏡觀察授粉后花粉管生長動態(tài);利用田間表型鑒定及SSR分子標記鑒定，鑒定雜交種，以結果率、種子數(shù)及種子發(fā)芽率為判斷指標研究不同雜交組合的親和性及授粉方式的可行性。結果表明，雜交組合親和性越高，花粉管生長越好;授粉后48 h花粉管基本進入子房的品種具有雜交結果能力;在5個雜交組合中，L81與赤茄雜交親和性最高，結果率為63.33%，種子發(fā)芽率為94.54%，其他雜交組合種子不能發(fā)芽;3種授粉方式中，重復授粉處理后雜交結果率及種子發(fā)芽率最高，花柱短截及混合授粉不能提高其坐果率及發(fā)芽率;雜交獲得了L81與赤茄的雜交植株，田間表型偏向父本性狀;篩選的17對SSR引物中，Q17能夠作為特異性引物鑒定雜交種，結果表明雜交植株為L81×赤茄的雜交種。

關鍵詞：栽培茄;赤茄;雜交;花粉管生長;SSR分子鑒定

中圖分類號：S641.103.6 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0140-06

茄子（Solanum melongena L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，具有很高的食用價值及藥用價值，具有豐富的茄堿、維生素P、花青素等物質[1]。隨著集約化生產(chǎn)及設施栽培的不斷推廣，在茄子生產(chǎn)栽培中連作障礙、環(huán)境污染等問題日益嚴重，因此開發(fā)抗性強的茄子新品種，是解決這些生產(chǎn)問題的關鍵。雜交是新品種創(chuàng)制常用手段，雜交可將不同親本中的基因進行重組，人工篩選符合育種目標的材料。

赤茄（Solanum integrifolium Pro.）中具有抵抗青枯病[2]、褐紋病[3]、枯萎病[4]、根結線蟲[5]、低溫[6]等生物脅迫及非生物脅迫的基因。通過赤茄及栽培茄之間的雜交可以將赤茄中優(yōu)良的抗性基因轉移到栽培茄中，豐富栽培茄的遺傳多樣性，為育種工作創(chuàng)造新的優(yōu)良種質資源。

赤茄與栽培茄雜交存在生殖隔離，在前人的研究中，赤茄與栽培茄雜交后結果率低，種子數(shù)少，其F1代沒有育性[7]。為解決生殖隔離，雜交種的培育技術在不斷地發(fā)展完善，Iwamoto等通過細胞融合獲得了四倍體雜交種[8-11];Verba等利用雜交及胚拯救獲得了雜交種[12]。

此外，通過不同的雜交技術處理可以提高遠緣雜交的成功率，景士西提出在同一母本花的花蕾期、開放期、即將凋謝期進行多次重復授粉，可以提高受精結實率[13];李潤根利用花柱短截提高了百合種間雜交坐果率[14];劉青林利用無活力的花粉作為蒙導花粉，摻入有活力的花粉進行雜交，發(fā)現(xiàn)花粉蒙導提高了雜交結實率[15]。本研究通過5種栽培茄作母本與赤茄進行雜交，運用不同的雜交方式，比較不同雜交方式對赤茄與栽培茄雜交親和性的影響;得到的雜交植株通過田間表型鑒定及SSR分子標記鑒定進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試母本5種栽培茄與父本赤茄均由揚州大學園藝植物保護學院課題組收集純化而來，于2019年春季栽植于揚州大學試驗苗圃基地（118.19°E、33.916°N）（表1）。

1.2 雜交方法

以5份栽培茄為母本、赤茄為父本進行雜交試驗。開花前1 d去雄，并進行綁線處理，開花當天 08：00—10：00進行授粉，授粉前柱頭涂抹453 mg/L槲皮素溶液，用鑷子挑取剛采下的花藥中的花粉進行授粉。授粉后20 d統(tǒng)計結果率，授粉后70 d統(tǒng)計種子數(shù)。

不同授粉處理方式：重復授粉（連續(xù)授粉3 d）、花粉管短截（第1天正常授粉，第2、3天每天截去1/2柱頭后授粉）、混合授粉（將失活的母本花粉與正常的赤茄花粉1 ∶ 1混合后進行授粉，連續(xù) 3 d）。授粉前均先使用453 mg/L槲皮素溶液涂抹柱頭。

1.3 花粉管生長觀察

摘取一次授粉后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、96 h 的花，快速放入卡諾氏固定液（95%乙醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1（V/V））固定12 h，于4 ℃冰箱保存過夜后放入320 g/L NaOH溶液中軟化1 h 后用蒸餾水重洗干凈，隨后放入0.1%苯胺藍磷酸溶液（pH值為8.5）中染色12 h，甘油壓片，用Olympus熒光顯微鏡紫外觀察并拍照。

1.4 雜種真實性鑒定

1.4.1 田間表型鑒定 參照李錫香等《茄子種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[16]，對雜種植株與其父母本的葉色、葉刺、花、果實等田間表型進行對比，確定雜交植株的真實性。

1.4.2 SSR分子鑒定 茄子全基因組DNA采用北京全式金植物基因組DNA抽提試劑盒進行提取，具體步驟參照說明書。所提DNA檢測采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法。在前期研究的基礎上選取17對引物進行SSR分子鑒定，引物序列見表2。SSR反應體系參照楊旭等的方法[17]，采用10 μL反應體系：6.7 μL ddH2O+1.0 μL 10×Buffer+1.0 μL DNA模板+1.0 μL 引物+0.2 μL dNTPs+0.1 μL rTaq聚合酶。擴增程序：95 ℃預變性 3 min;95 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。取擴增后產(chǎn)物2 μL和0.4 μL 6×Loading Buffer混合點樣于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，進行電泳檢測，以DL700 DNA Maker為對照。電泳條件：150 V恒壓1.5 h。使用銀染法進行膠片觀察。

2 結果與分析

2.1 不同雜交組合花粉管生長狀態(tài)

由圖1、 圖2可知， 5個雜交組合雜交后其花粉管生長狀態(tài)不同，除L108外，其他4個品種的柱頭授粉后，在4 h 時能看到明顯的花粉附著，8 h 時萌發(fā)出花粉管扎入花柱，48 h 時基本到達花柱基部進入子房，96 h 時全部到達子房。L108柱頭授粉后在8 h 時發(fā)現(xiàn)花粉附著，但全程未有扎入花柱的花粉管。L106、L51、L171及L81花柱授粉后，花粉管生長速度不同，L81花柱中花粉管生長速度最快，L106次之，L51最慢，花粉在花柱中的生長速度與雜交組合雜交親和性分析一致。由此可見，花粉管在花柱中的發(fā)育狀態(tài)是判斷雜交組合親和性的指標之一。

2.2 不同授粉方式下雜交親和性

由表3可知，不同雜交組合親和性不同，L81×C雜交結果率最高，為63.33%，獲得的165粒種子中94.54%能正常發(fā)芽，因此L81×C雜交親和性最高;L106×C雜交結果率較高，為26.67%，獲得的27粒種子不能正常發(fā)芽;L51×C雜交結果率為13.33%，僅獲得7粒種子且不能正常發(fā)芽;L171×C結果率為6.67%，但獲得29粒種子，種子不能正常發(fā)芽;L108×C雜交親和性最低，沒有獲得果實。由此可見，栽培茄與赤茄雜交可能存在2個階段的雜交障礙，第1階段為受精階段，此階段的受精效果決定最終的雜交結果率;第2階段為胚胎發(fā)育階段，此階段胚胎發(fā)育的效果決定了雜交的結子數(shù)及發(fā)芽率。基因型是決定雜交成功率的決定因素。

由表4可知，花柱短截不能提高雜交的親和性，其雜交結果率最低，為18.00%，結籽數(shù)為67粒，種子發(fā)芽率僅為40.30%;混合授粉與重復授粉結果率一致，但混合授粉后種子數(shù)比重復授粉少49粒，發(fā)芽率降低1.57百分點。由此可見，3個雜交處理方式中，重復授粉為最適宜栽培茄與赤茄的雜交處理方式，混合授粉的效果低于重復授粉，可能由于混合授粉降低了赤茄花粉濃度，花柱短截效果不佳，可能由于花柱短截對柱頭造成傷害，導致花柱產(chǎn)生抵抗物質，降低了授粉效率。

由表5可知，不同授粉處理方式對同一雜交組合的作用效果不同。在L106×C中，重復授粉作用效果最好，授粉后雜交結果率及結籽數(shù)均為3種處理方式中最高，結果率為33.33%，獲得16粒種子;混合授粉后結果率較重復授粉后結果率下降6.66百分點，未獲得種子;花柱短截后較重復授粉后結果率下降13.33百分點，獲得種子數(shù)少5粒;此雜交組合未能獲得可育種子。在L108×C中，3種授粉處理方式均不能正常結果。在L51×C中，花柱短截后結果率最高，為30.00%，比重復授粉后高26.67百分點;花柱短截后此雜交組合結果率比混合授粉后高23.33百分點，混合授粉后獲得7粒種子，但種子不能發(fā)芽。在L171×C中，混合授粉后雜交結果率最高，為16.67%，但未獲得種子，雜交結果率比花柱短截高13.34百分點，花柱短截后獲得了29粒種子，但種子未能發(fā)芽;重復授粉后未能結果。在L81×C中，重復授粉作用效果最好，授粉后結果率為66.67%，獲得84粒種子，種子發(fā)芽率為95.24%;混合授粉后結果率、種子數(shù)及種子發(fā)芽率均下降，結果率下降13.34百分點，獲得種子數(shù)下降40粒，種子發(fā)芽率下降4.34百分點;花柱短截后結果率及種子數(shù)均為3種授粉處理方式下最低，結果率為36.67%、種子數(shù)為27粒，但種子發(fā)芽率為100.00%。

相同授粉處理方式對不同雜交組合的作用效果不同。使用重復授粉后，L81×C雜交結果率、種子數(shù)及發(fā)芽率均最高;L106×C雜交后結果率、結籽數(shù)次之;L51×C雜交后能夠結果，但結果率低，授粉后只獲得1個果實，未獲得種子;L108×C、L171×C雜交后沒有結果。使用花柱短截后，L81×C雜交結果率為36.67%，獲得27?？捎N子;L51×C雜交結果率為30.00%，但未獲得種子;L106×C雜交結果率為20.00%，卻獲得11粒種子;L171×C結果率為3.33%，但獲得29粒種子，為5種雜交組合中最多，種子未能發(fā)芽。使用混合授粉方式下，L81×C雜交結果率最高，為53.33%，獲得的44粒種子中90.90%可育;L106×C及L171×C雜交結果率次之，結果率分別為26.67%、16.67%，但未能獲得種子;L51雜交結果率為6.67%，但獲得7粒形態(tài)完整的種子，種子未能發(fā)芽。

綜上所述，基因型為影響栽培茄與赤茄雜交親和性的重要因素，改變授粉處理方式不能克服不親和組合的雜交障礙，僅能在某種程度上改變較親和組合的結果率及種子獲得數(shù)。

2.3 雜交植株鑒定

2.3.1 田間表型鑒定 將L81×C獲得的F1與其父母本進行田間表型對比，結果表明：F1植株田間表型具有雙親特征，葉面積大于父母本，葉色、葉脈色、葉刺、花冠色、花序及商品果色偏向父本赤茄，花瓣色及果形為中間值，該雜交組合能夠正常結果，但未獲得種子。根據(jù)田間表型鑒定該雜交植株為L81×C的雜交種（表6、圖3）。

2.3.2 SSR分子鑒定 為檢測獲得的L81×C雜交植株的真實性，選取17對隨機引物對獲得的3株雜種幼苗進行PCR擴增。根據(jù)凝膠電泳銀染結果，能夠對雜交種真實性鑒定的引物是Q17，Q17在L81及赤茄中存在特異性。圖4為引物Q17對雙親、F1雜種植株擴增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物電泳銀染檢測結果，可以看出，F(xiàn)1植株繼承了赤茄的特征譜帶，L81植株在該引物下未產(chǎn)生條帶，說明再生植株不是由栽培茄自交產(chǎn)生，為L81×C的雜交種，由此可知，本試驗所鑒定的雜種植株為L81×C雜交種。

3 結論與討論

雜交能夠將赤茄的抗性基因轉移至栽培茄中，豐富栽培茄的遺傳多樣性，為茄子育種提供重要的研究材料。當使用栽培茄作父本、野生茄作母本時不能正常結果，而當野生茄作父本時，能夠獲得正常果實[18]。本試驗以5種栽培茄作母本、赤茄作父本進行雜交親和性分析及雜交種鑒定，研究結果如下：（1）基因型是影響雜交親和性的決定因素，需要篩選大量的雜交組合來創(chuàng)制遠緣雜交種，此結果與ürük等的結論[19-20]一致。（2）授粉后，父本花粉在L81、L51、L106及L171 4個栽培種柱頭上萌發(fā)良好，伸長速度快，48 h基本進入子房，在L108栽培種柱頭上無法萌發(fā)。此現(xiàn)象可能是由于不親和品種母本柱頭抑制類分泌物的產(chǎn)生阻止了花粉管的萌發(fā)[21]。（3）3種雜交處理方式的作用效果為重復授粉>混合授粉>花柱短截，此結果與賀丹等的研究結果[22]一致。但是也有人認為，花柱短截能夠提高雜交的親和性[14，21]，造成結果差異的原因可能是基因型差異。（4）獲得了L81與赤茄的雜交植株，其余雜交植株沒有獲得可育種子，此結果與Devi等的研究結果[7]一致，其獲得的雜交果實也沒有可育種子，而Verba等則獲得了未發(fā)育完全的種子，通過胚挽救獲得了雜交種植株[12]。（5）雜交種進行田間表型鑒定及SSR分子鑒定結果表明，L81與赤茄的雜種田間表型偏向父本赤茄，主要表現(xiàn)在葉色、葉脈色、葉刺、花冠色、花序、商品果色上;在花色、果形上表現(xiàn)出中間特征，此結果可能與野生茄中的性狀多由顯性基因控制有關，與柳李旺等在茄子遠緣雜交研究中獲得的結論[23-24]相似。從17對引物中篩選出Q17，Q17在赤茄與L81上具有特異性，并且通過鑒定證實所得雜交種為赤茄與L81雜交種。

參考文獻：

[1]San José R，Sánchez-Mata M C，Cámara M，et al. Eggplant fruit composition as affected by the cultivation environment and genetic constitution[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94（13）：2774-2784.

[2]趙曾菁. 茄子砧木種質資源對青枯病的抗性及雄性不育特性的研究[D]. 南寧：廣西大學，2016.

[3]謝艷華，蘇志強，曹學文. 不同砧木嫁接對茄子生長及抗褐紋病的影響[J]. 廣東農業(yè)科學，2014，41（15）：29-32.

[4]吳麗艷，郭志祥，曾 莉，等. 云南野生茄資源黃萎病苗期人工接種抗性鑒定分析[J]. 植物遺傳資源學報，2017，18（6）：1046-1054.

[5]徐小明，于 芹，徐 坤，等. 南方根結線蟲侵染對茄子砧木幼苗根系活性氧代謝及相關酶活性的影響[J]. 園藝學報，2008，35（12）：1767-1772.

[6]張曉艷，徐 坤. 低溫弱光條件下砧穗互作對茄子嫁接苗抗冷性的影響[J]. 中國農業(yè)科學，2009，42（10）：3734-3740.

[7]Devi C P，Munshi A D，Behera T K，et al. Cross compatibility in interspecific hybridization of eggplant，Solanum melongena，with its wild relatives[J]. Scientia Horticulturae，2015，193：353-358.

[8]Iwamoto Y，Hirai M，Ohmido N，et al. Fertile somatic hybrids between Solanum integrifolium and S. sanitwongsei （syn. S. kurzii） as candidates for bacterial wilt-resistant rootstock of eggplant[J]. Plant Biotechnology，2007，24（2）：179-184.

[9]Rotino G L，Sihachakr D，Rizza F，et al. Current status in production and utilization of dihaploids from somatic hybrids between eggplant （Solanum melongena L.） and its wild relatives[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2005，27（4）：723-733.

[10]Tamura N，Murata Y，Mukaihara T. A somatic hybrid between Solanum integrifolium and Solanum violaceum that is resistant to bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum[J]. Plant Cell Reports，2002，21（4）：353-358.

[11]Isshiki S，Okubo H，F(xiàn)ujieda K. Segregation of isozymes in selfed progenies of a synthetic amphidiploid between Solanum integrifolium and S.melongena[J]. Euphytica，2000，112（1）：9-14.

[12]Verba V M，Mamedov M I，Pyshnaya O N，et al. Isolation of eggplant interspecific hybrids by the method of embryo culture [J]. Sel skokhozyaistvennaya Biologiya[Agricultural Biology]，2010（5）：66-71.

[13]景士西. 園藝植物育種學總論[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2000.

[14]李潤根. 不同授粉方式對食用百合種間雜交結實的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（21）：140-142.

[15]劉青林. 梅花遠緣雜交與雜種無性系的研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學，1996：1-5.

[16]李錫香，朱德蔚. 茄子種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2006.

[17]楊 旭，劉 飛，霍秋月，等. SSR分子標記鑒定栽培茄與野生茄雜種F1研究[J]. 東北農業(yè)大學學報，2017，48（10）：20-27.

[18]Rattan P，Kumar S，Salgotra R K，et al. Development of interspecific F1 hybrids （Solanum melongena×Solanum khasianum） in eggplant through embryo rescue technique[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2015，120（1）：379-386.

[19]ürük S，Dayan A. Production of diploid and amphidiploid interspecific hybrids of eggplant and Solanum torvum，and pollen fertility[J]. Journal of Animal & Plant Sciences，2018，28（5）：1485-1492.

[20]霍秋月. 茄子種間雜交及其F1代花藥培養(yǎng)[D]. 揚州：揚州大學，2017.

[21]郭玉潔，楊會娟，曹 宇，等. 山丹與幾種百合的雜交及花粉管生長熒光觀察[J]. 江蘇農業(yè)科學，2018，46（14）：116-120.

[22]賀 丹，張佼蕊，何松林，等. 授粉方式對牡丹和芍藥遠緣雜交受精前障礙的影響[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2020，48（3）：99-106.

[23]柳李旺，龔義琴，汪隆植，等. 栽培茄與紅茄種間雜交及其雜種的特性分析[J]. 南京農業(yè)大學學報，2004，27（1）：6-10.

[24]謝文剛，張新全，陳永霞. 鴨茅雜交種的SSR分子標記鑒定及其遺傳變異分析[J]. 草業(yè)學報，2010，19（2）：212-217.左李娜，王 容，劉 丹，等. 多頭切花菊瓶內開花技術的研究[J]. 江蘇農業(yè)科學，2020，48（23）：146-149.