新冠病毒試劑盒與“假陰性”之困

霍思伊　胥大偉

在尚無法準確預測疫情拐點的當下，如果確診手段無法保證結果準確，出現(xiàn)錯檢和漏檢，直接后果將是，很多核酸檢測陰性但仍攜帶病毒的人得不到隔離，他們將成為新的傳染源。

一個典型的案例是，天津一女性感染病例，1 月 21 日出現(xiàn)發(fā)熱后，前后共做了三次核酸檢測均呈陰性，2月1日第四次檢測后才呈陽性。

為何試劑盒檢測會頻頻出現(xiàn)假陰性？

就此問題，多位專家向《中國新聞周刊》解釋，試劑盒檢測結果不僅與試劑盒質量有關，還與新冠病毒自身的特點、采樣部位、采樣量、運輸和儲存環(huán)節(jié)，以及實驗室檢測條件和人員操作有關，由多種原因構成，非常復雜，但其中最關鍵的因素，與這次病毒的特殊性有關。

每個環(huán)節(jié)出錯都可能造成結果不準確

一位專門從事核酸檢測的國家某重點實驗室研究員告訴《中國新聞周刊》，由于新冠病毒的特殊性，不同的采樣部位對檢出率有很大影響。

他指出，最好的采樣部位是肺部，因為這種病毒分布在肺部的濃度最大，但要想采肺泡灌洗液，操作復雜，需要儀器和各種引管，且對人的損傷很大，因此只針對上了呼吸機的重癥病人;其次是痰，但這次肺炎不像以往的甲流，很多病患干咳，無痰。因此，最普遍也最簡單的采樣方式是咽拭子，而咽部的新冠病毒量最少，所以會造成漏檢。

另一位疾控系統(tǒng)內專門研究核酸檢測的專家對《中國新聞周刊》指出，有研究表明，新冠病毒在人的上皮細胞復制非常慢，因此，在咽部，甚至痰液內，病毒的基數(shù)都非常低，加大了檢測的難度。

“有的病人幾次（檢測）才呈陽性，這是正常的。因為可能病人前期分泌的病毒量很少，后期隨著病情的發(fā)展，病毒增多，才能檢測出來。”前述研究員說。

另外，是否采樣準確、采到了關鍵部位，也會影響采樣結果。以咽拭子為例，雖然是很簡單的操作，只需要在咽部拿一個棉簽劃一下，但每個醫(yī)護人員劃的輕重、多少都不相同。尤其在武漢，在日均檢測量超負荷的狀態(tài)下，穿著厚重防護服的醫(yī)護人員要實現(xiàn)精準采樣，難度很大。

除了采樣，從樣本運輸?shù)綄嶒炇覚z測的諸多環(huán)節(jié)中，每一個環(huán)節(jié)出錯都可能造成檢驗結果的不準確。

由于病毒的RNA很容易降解，敏感度很高，送樣過程中必須采取冷鏈運輸，維持在零下20度，一旦凍融超過四次以上，樣本就會受到損傷。此前，首批通過國家藥監(jiān)局審批的6家新冠病毒試劑盒生產(chǎn)企業(yè)之一、上海之江生物科技股份有限公司曾對媒體表示，由于試劑盒要求零下 20 度的儲存環(huán)境，僅少數(shù)有冷鏈能力的物流企業(yè)可以承運。在運輸過程中稍不注意，有可能就會影響試劑盒最終的檢測結果。

而且，利用試劑盒檢測有很高的門檻，對實驗室的條件也很苛刻。前述研究員告訴《中國新聞周刊》，理論上PCR（即聚合酶鏈式反應）檢測必須在生物安全防護達到三級的P3實驗室做，但由于疫情原因，為了短期內快速提高檢測能力，國家將標準放寬，也允許P2實驗室進行檢測，但防護手段要達到P3，比如穿著3級的防護服，檢測人員被要求在生物安全柜里進行操作。

他指出，病毒基因擴增非常容易交叉污染，所以實驗室要分區(qū)，提取樣品、發(fā)生反應和調配試劑要分別在三個相互獨立的房間，房間之間形成壓差梯度，前一環(huán)節(jié)房間的壓力要大于后一環(huán)節(jié)，以保證擴增的分子不倒流，否則試劑容易被污染，造成假陽性，“這也是實驗室目前最頭疼的一個問題”。

這對檢測人員的操作規(guī)范提出了很高的要求。前述疾控系統(tǒng)專家指出，樣本檢測過程中會遇到很多問題，比如有時候擴增曲線沒出來，缺乏經(jīng)驗的檢測人員很難判斷，是試劑盒質量問題還是操作問題?！斑@不是一天兩天能培訓出來的，需要積累大量的經(jīng)驗?！?/p>

自1月26日中國疾控中心把檢測權限下放給各地市的三甲醫(yī)院后，湖北省共有41家醫(yī)院獲得了檢驗資格。目前，已經(jīng)擴展到66家。但一般醫(yī)院只有P2實驗室，即便臨時上馬，將防護做到位，專業(yè)檢測人員的缺乏仍是個問題。

一份湖北省臨床檢驗中心官網(wǎng)2019年1月發(fā)布的消息稱，湖北第十六期PCR實驗室技術人員上崗培訓班的參加人數(shù)為268人，2018年為220余人。

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科劉為勇在接受媒體采訪時坦言，檢驗師要有一定資質和從業(yè)經(jīng)驗，并不是每個人都能做的?！皺z驗科的人手不夠，我們還是以前那些人，大概十幾個。除了檢測以外，現(xiàn)在還要手動整理、上報大量患者信息?！?p>

2月6日，位于東湖高新區(qū)的武漢“火眼”實驗室正在試運行，檢驗員當天對90人（份）已經(jīng)滅活的樣本，進行新型冠狀病毒核酸檢測試驗?！盎鹧邸睂嶒炇覍槲錆h及周邊城市提供充足的檢測能力，每日最多可檢測萬人份新型冠狀病毒樣本。攝影/長江日報 周超

新冠病毒試劑盒生產(chǎn)企業(yè)重慶中元匯吉生物技術有限公司（簡稱中元生物）的一位技術專家告訴《中國新聞周刊》，目前的檢測模式包括手工監(jiān)測和全自動儀器檢測兩種。其中，手工檢測要求檢測人員必須具備相關的專業(yè)背景，操作還要熟練化，“檢測過程就像看病理切片，短期突擊培訓的人員很難勝任檢測工作”。

截至2月4日，整個湖北省能夠提供PCR檢測的實驗室共有97家，包括省市的各級疾控中心18家、66家醫(yī)院，以及13家第三方檢測機構，日均檢測量能達到6000人份。

具體到武漢，截至目前，武漢市共有31家機構同時開展核酸檢測，核酸單日樣本檢測能力由最初的200份，提升到每日4000余份。據(jù)武漢市新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控指揮部介紹，武漢核酸檢測的最高能力，目前最高可達到日6000～8000份。

按照指揮部的部署，要在2月5日至7日兩天內，完成武漢市所有疑似病例的核酸檢測。

在2月6日的湖北省政府新聞發(fā)布會上，武漢市衛(wèi)生健康委主任張紅星表示，目前核酸檢測試劑能滿足需求，但是采樣管、防護設施、采樣人員還有一定缺口。

前述疾控專家指出，目前，無論是試劑盒增產(chǎn)能，還是實驗室布局，檢測的條件已經(jīng)基本改善了，下一步更關鍵的是，如何嚴格操作，提高實際的檢測能力。

他說，“你把檢測權不斷下放到醫(yī)院，要看它有沒有這個條件，具不具備這個能力。不能光把數(shù)字上滿足了，但無法滿足真正在一線的需求，產(chǎn)能是否滿足和是否能把病人治好是兩回事?！?h3>應急審批，流程從幾年縮短到幾天

2月3日，工信部黨組成員、總工程師田玉龍在國新辦發(fā)布會上表示，截至 2月1日，各家企業(yè)的日均試劑盒產(chǎn)能合計達到77.3 萬人份，相當于疑似患者的40倍，而且這還只是“最大產(chǎn)能的百分之六七十”。

多家試劑盒生產(chǎn)企業(yè)告訴《中國新聞周刊》，試劑盒供需缺口的很快消弭，得益于國家藥監(jiān)局迅速推出的“綠色審批通道”。

1月22日，在武漢成立疫情防控指揮部當天，17家企業(yè)在國家藥監(jiān)局的召集下，進行了一場現(xiàn)場應急答辯。此前，他們收到通知，由于新冠肺炎疫情嚴重，一線醫(yī)院在短期內需要大量試劑盒進行檢測，國家藥監(jiān)局決定開啟快速審批通道，特事特辦。

一位當時參與答辯的企業(yè)負責人告訴《中國新聞周刊》，雖然通知得很匆忙，但相關的材料仍要準備齊全，和以往申報這類體外診斷試劑時提交的材料類似，主要包括綜述資料、原材料、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品說明、連續(xù)3個生產(chǎn)批次的注冊檢驗等?，F(xiàn)場有很多專家作為評委，在企業(yè)詳細匯報后進行表決。最終，有7家企業(yè)進入了應急審批通道。

1月26日，國家藥監(jiān)局發(fā)布公告，稱4家企業(yè)通過了應急審批，整個審批流程僅耗時4天。

此后，又分別于1月28日和1月31日先后共批準6家新型冠狀病毒試劑盒生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品上市，分別是上海之江、圣湘生物、上海捷諾、上海伯杰醫(yī)療、中山大學達安基因以及華大基因。輝睿生物目前仍處于審批中。

這個速度，被前述研究員稱為“史無前例的快”。他說，以埃博拉病毒為例，在當時那種緊急狀態(tài)下，都是做完臨床之后一個月才批的。

事實上，新冠病毒試劑盒這種與致病性病原體抗原、抗體以及核酸等檢測相關的試劑，按國家法規(guī)，屬于體外診斷試劑的第三類，也就是醫(yī)療器械中的最高審查級別，需要由國家食品藥品監(jiān)督管理總局審查，因此審查程序也繁瑣漫長。

正常情況下，審批至少要2～3年，不順利的話有時會拖到5年，經(jīng)常會要求補交各種材料，比如臨床數(shù)據(jù)。以前，對試劑盒的穩(wěn)定性研究就要求至少一年，也就是放置在零下20℃的環(huán)境內至少一年，實際要放置至少14個月。

國家藥監(jiān)局的官方通告指出，雖然這次是特事特辦，但按照“統(tǒng)一指揮、早期介入、隨到隨審、科學審批”的原則進行審批，不省流程，不降低標準。

一家首批獲批的企業(yè)總經(jīng)理告訴《中國新聞周刊》，國家藥監(jiān)局為每家企業(yè)指派兩名審批咨詢老師，雙方共建一個微信群，在群內及時溝通審批事宜，幾乎秒回。她還記得一個細節(jié)，有一天夜里三點，對方突然在群里問，你這個資料準備好了嗎？“他們工作不分晝夜，很辛苦，確實是想要盡快把企業(yè)審批出來。”她說。

但前述研究員指出，從幾年縮短到幾天，沒有降低標準是不可能的。據(jù)他透露，首批審核的都允許減免臨床試驗，這在一定程度上降低了試劑盒的質量門檻。但這位研究員也承認，在目前這種應急狀態(tài)下，如果照搬老規(guī)定，是不行的。

按以前的規(guī)定，一個試劑盒產(chǎn)品的申報必須上交三家具有臨床資質的醫(yī)療機構共500人的病歷數(shù)據(jù)，并有三家單位的簽字蓋章。其中，是否在對這500個病人使用試劑盒之前征得對方的同意，這涉及倫理問題，必須把完整的方案遞交所在醫(yī)療機構的倫理委員會審核，經(jīng)審核同意后和病歷數(shù)據(jù)一起提交?！肮鈧惱磉@個環(huán)節(jié)，沒半年下不來的?！彼f。

為了彌補這個漏洞，在首批獲得《醫(yī)療器械注冊證》的備注一欄，國家藥監(jiān)局都注明了：本產(chǎn)品僅為新冠病毒感染的肺炎的輔助診斷及應急儲備，有效期1年。延續(xù)注冊時要補交臨床數(shù)據(jù)。以前，這類證件的有效期一般是五年。

正參與第二批評審的深圳普瑞康生物技術有限東莞公司董事長黃高健告訴《中國新聞周刊》，第二批申報中，要求比第一批要高，不能減免臨床，而要求提交三家機構的數(shù)據(jù)。但仍比常規(guī)要求低，沒有明確要求，這三家醫(yī)療機構必須是有臨床資質的，相當于放寬了臨床數(shù)據(jù)獲得的范圍，并且不要求倫理審查。

據(jù)他透露，在第二批審核中，國家藥監(jiān)局把初篩權下放給各省，先由各省藥監(jiān)局組織初篩，通過后由省里向國家報。整個過程節(jié)奏也很快，接到省里通知后第二天就去答辯。目前，他正等待國家藥監(jiān)局的審批結果。

據(jù)他了解，第二批申報的企業(yè)超過100家，僅廣東省就有近30家。

高產(chǎn)能背后

多位行業(yè)內人士向《中國新聞周刊》指出，由于PCR檢測的技術門檻不高，目前，全國多家生物技術公司紛紛加入到檢測試劑盒的生產(chǎn)浪潮中，這從第二批申報激增的企業(yè)數(shù)量就可以看出，對于這個此前較為小眾的行業(yè)而言，新的入局者不斷涌入，其中不乏沒有太多經(jīng)驗的小企業(yè)。

前述研究員指出，目前，各企業(yè)正在研發(fā)生產(chǎn)的核酸檢測試劑盒基本都采用熒光 PCR 技術。這個技術早在1983年由美國科學家凱利·穆利斯提出，隨后被應用于病毒檢測、法醫(yī)鑒定和考古學等多個領域，后來經(jīng)過數(shù)個版本的優(yōu)化，技術本身已經(jīng)非常成熟，也有一套完整的工藝體系。

PCR技術的原理，是將新冠病毒的一段RNA片段逆轉錄成雙鏈DNA，再通過DNA聚合酶進行擴增。原始的病毒遺傳信息極其微量，不易被發(fā)現(xiàn)，擴增后更易被識別出來，然后通過一種熒光探針來捕捉，當擴增后的病毒濃度達到一個臨界值時，就會產(chǎn)生熒光信號——這意味著，樣本中被檢測出攜帶新冠病毒。

在此前的埃博拉、甲性H1N1流感和中東呼吸綜合征等病毒的檢測中，都使用了這種技術。也就是說，試劑盒檢測的方法和技術已經(jīng)是一套固定的成熟體系，每次只要套用不同的病毒基因就行，技術門檻不高。

2月4日，在武漢市的一處隔離點，醫(yī)護人員為被隔離者取咽拭子。攝影/長江日報 陳卓

疾控人員對被隔離者的樣本進行封存。攝影/長江日報 陳卓

因此，在1月10日，國家公布了新冠病毒全基因組序列之后，1月13日至14日，已有多家公司宣稱研發(fā)出核酸檢測試劑盒。中元生物在新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的研制只花了兩天的時間，該公司一位負責人對《中國新聞周刊》指出，由于中元生物在體外診斷試劑研發(fā)方面多有技術積累，研發(fā)新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒就好比“多加一個菜”。

多位受訪的試劑盒生產(chǎn)企業(yè)告訴《中國新聞周刊》，他們試劑盒的研制只用了兩三天。

雖然門檻不高，但在前述疾控專家看來，在選取RNA片段（靶序列）、引物和探針的設計，以及一整套工業(yè)流程的優(yōu)化方面，要求企業(yè)有至少五年以上的積累和沉淀。否則，雖然基本的技術方法就是PCR，但試劑盒質量仍然良莠不齊。

他指出，衡量試劑盒的質量，主要有三個指標，特異性、靈敏度和重復性。特異性好，就意味著這個試劑盒只能檢測新冠病毒，而不是其他病毒，比如流感或腺病毒。靈敏性高，就會減少漏檢概率，檢出率高。重復性強，則代表穩(wěn)定性好。因此，三個指標中，最重要的是靈敏度，這也是各種不同試劑盒質量差異的核心所在。

他說，現(xiàn)有這些公司的技術，只要是通過國家藥監(jiān)局審批，也即在技術標準層面通過其下屬的中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）檢定的，特異性一般都能保證在99%以上，但靈敏度各家不同?！爸袡z院的鑒定標準是一個最低門檻，過了這個門檻上面還有好幾個臺階，有的更高一點，有的更低一點。不同的靈敏度，對檢測的準確性影響很大，有的很靈敏，濃度很低的病毒也可以檢測出來，就不會漏檢，有的不太靈敏，就會出現(xiàn)假陰性。”

隨著疫情的發(fā)展，對于檢測試劑質量標準的要求不僅僅是快，更要求保證高靈敏度。然而，現(xiàn)實是，相關檢測試劑的研發(fā)生產(chǎn)缺乏統(tǒng)一且明確的行業(yè)標準。

據(jù)中元生物前述技術專家介紹，在診斷試劑行業(yè)，行業(yè)標準雖然早已存在，但標準對于不同產(chǎn)品中品類的限制并沒有細化。新冠病毒是新近發(fā)現(xiàn)的，讓國家去主導做一個新冠肺炎試劑的標準，短期內是不現(xiàn)實的。在他看來，目前行業(yè)內免不了一些企業(yè)借著試劑盒的噱頭進行炒作。在此次的疫情防護過程當中，相關檢測試劑廠家的產(chǎn)品之間，質量存在參差不齊的現(xiàn)象。