微生物來源的天然產(chǎn)物研究進展

張琳，宮春杰

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430086）

天然產(chǎn)物是動物、植物以及微生物體內(nèi)的組成成分或代謝產(chǎn)物，具有不同的生物學功能，在自然界中廣泛存在。例如，食用天然色素主要是從動植物組織中提取；抗生素主要是微生物產(chǎn)生的具有抗病原體功能的次級代謝產(chǎn)物。目前，人們對許多天然產(chǎn)物的功能尚不了解，需要進一步進行探索研究。微生物作為生態(tài)環(huán)境中廣泛存在的一類群體，蘊藏的天然產(chǎn)物是有待發(fā)現(xiàn)的資源寶庫。

1 天然產(chǎn)物概述

1.1 天然產(chǎn)物種類

天然產(chǎn)物主要包括萜類、甾體、香豆素類、酮類、抗生素、色素、有機酸、蒽醌、多糖、多肽、脂肪酸以及蛋白質(zhì)等[1]。近年來，研究人員關(guān)于新型天然產(chǎn)物開展了大量的研究工作，如尼瑞斯制藥公司從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)的化合物NPI-3114和NPI-3304具有抗菌性[2]；或采用新技術(shù)提高產(chǎn)量，如重建菌株黑曲霉T132發(fā)酵產(chǎn)酒精，將轉(zhuǎn)化率提高到86.8%[3]。在我國經(jīng)濟增長和豐富物種資源背景的推動下，天然產(chǎn)物的研究也獲得了具有一些新類型、新結(jié)構(gòu)的原創(chuàng)性成果。

1.2 天然產(chǎn)物功能

天然產(chǎn)物本質(zhì)為次級代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)和化學成分復雜，需其他小分子作為底物經(jīng)催化反應合成，具有一定的生物活性和功能[4]。天然產(chǎn)物具有種類、結(jié)構(gòu)和功能多樣性的特點。目前，天然產(chǎn)物在藥物開發(fā)和代謝研究中應用廣泛，可用作治療劑、化妝品和農(nóng)藥等，這些產(chǎn)品多達千種。例如，花生四烯酸可降低患腫瘤的風險，預防心腦血管病，可由嗜冷菌希瓦氏菌（Ac10）低溫誘導生產(chǎn)[5]。海洋中由于鹽濃度高、壓強大、溫度低，使海洋微生物具有區(qū)別于陸生微生物的代謝途徑，從而生產(chǎn)獨特的天然產(chǎn)物，因此海洋生物是天然產(chǎn)物的主要資源寶庫。如海洋鏈霉菌（TPA0879）能夠產(chǎn)生含有一個γ-內(nèi)酯的聚酮類化合物，可有效抑制癌細胞的擴散[6]。由此可見，天然產(chǎn)物可用于醫(yī)學治療，或農(nóng)業(yè)上用于防治有害生物，或用作藥劑的模板物、引導物[4]。目前，已有不同生物種屬來源的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)并應用，如分離于細菌的抗寄生蟲藥伊維菌素、抗腫瘤藥物博萊霉素和阿霉素，分離于短皮酵母和桔霉的抗真菌藥物等。

2 微生物來源的天然產(chǎn)物的應用

2.1 天然產(chǎn)物與抗癌藥物

天然產(chǎn)物作為藥物或前體可用作抗癌藥物或用于相關(guān)研究，目前，約50%的溶瘤藥物來自天然產(chǎn)物。如卡非佐米可治療多發(fā)性骨髓瘤，羅米地辛用于T細胞淋巴瘤的治療，通過天然產(chǎn)物溶瘤劑可靶向其他分子靶標。深海皮生球菌（MT1.1和MT1.2）能夠產(chǎn)生吩嗪類化合物，通過對K562細胞的IC50值（半抑制濃度）可以確定其可以用于腫瘤治療研究[6]。從海綿黑松枝菌分離出類似于片胺的酚吡咯、新阿米拉林和5-羥基新阿米拉林具有抗腫瘤功能，可以抑制HIV-1整合酶和MCV拓撲異構(gòu)酶[7]。

2.2 天然產(chǎn)物與抗心腦血管疾病

心腦血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一，占總死亡人數(shù)的1/3，超過了其他各類癌癥、傳染病和意外傷害造成的死亡人數(shù)，所以降低其死亡率至關(guān)重要，其藥物研究也必不可少。如他汀類藥物分子康帕以及洛伐他汀是從青霉和曲霉中發(fā)現(xiàn)的兩種天然產(chǎn)物分子，可抑制細胞內(nèi)膽固醇的合成，從而預防和治療冠心病[8]。

2.3 天然產(chǎn)物與移植

移植是一種常見的治療手段，能引起機體的組織排斥反應，如從原核微生物提取物中分離得到鑭硫磷的環(huán)狀肽杜拉霉素可作為拮抗劑，抑制移植排斥反應[9]。從多孔木霉菌中發(fā)現(xiàn)的環(huán)孢霉素，在早期也被應用于抑制排斥反應。另外，器官移植過程中易遭受真菌感染，但不宜使用抗生素，而天然產(chǎn)物中有很多抗真菌化合物，并很少產(chǎn)生抗藥性。例如，在微生物次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的白僵菌素、小檗堿以及雷帕霉素等已被廣泛用于臨床[10]。

2.4 天然產(chǎn)物與抗菌劑

日常生活中，有些微生物對人們生活可造成負面影響，發(fā)現(xiàn)和研究抗菌劑具有重要意義。例如，鏈霉菌素是從鏈霉菌培養(yǎng)物中分離，具有抗菌性能。目前，分離的抗菌化合物有絲裂霉素C、波非羅霉素、放線菌素、利福霉素和格爾丹霉等。從海洋低溫環(huán)境生長的真菌康氏木霉中分離得到5個新的聚酮衍生物，分別為7-鄰甲基甲酰胺和木霉酮A、木霉酮B、木霉酮C和木霉酮D，對細菌有抑制作用和協(xié)同抗真菌活性[11]。此外，被毛孢（BCC）產(chǎn)生的天然環(huán)肽Hirsutellide A表現(xiàn)出抗分枝桿菌活性[12]。

2.5 天然產(chǎn)物與植物促生

植物與微生物共生的關(guān)系是目前的研究熱點，植物根部的微生物種類豐富，從中可以發(fā)現(xiàn)大量促進植物生長的物質(zhì)[13]。例如，可可醇是一種環(huán)氧環(huán)己烯化合物，是從誘導馬鈴薯小薯的真菌培養(yǎng)濾液中分離而得，噴灑在馬鈴薯和牽?；ǖ戎参镏校梢詼p短塊莖和花芽形成時間，故可應用于種子、花蕾等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[14]。從黃絲曲霉（FS2）中釋放的β-石竹烯可以刺激植物生長和提高植物抗性或耐性，且實際研究中發(fā)現(xiàn)其可促進白菜生長和誘導其產(chǎn)生抗病性[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)假單胞細菌可保證植物保持健康不感染疾病，研究微生物與植物的相互作用可以發(fā)現(xiàn)細菌可產(chǎn)生促植物生長化合物。

2.6 天然產(chǎn)物與抗衰老

衰老是機體退化的特征，服用有機合成藥物抗衰老對人體傷害較大，而天然產(chǎn)物副作用小，在開發(fā)抗衰老藥物上有獨特的優(yōu)勢，目前已有幾十種具有抗衰老作用的天然藥物被報道。如研究人員對黃絲曲霉（ABRF2）發(fā)酵粗提物中分離得到3-甲基-4-氧代戊酸，該物質(zhì)在抗衰老和抗癌的分子對接分析中，與標準藥物相比具有更強的結(jié)合能力，有作為開發(fā)抗衰老藥物的潛力[16]。此外，對黃乳牛肝菌的發(fā)酵物進行乙醇提取，發(fā)現(xiàn)其提取物具有很好的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤活性，所以對其提取物進行分析，有進一步開發(fā)成藥物的可能[17]。

3 天然產(chǎn)物成分分析方法

3.1 毛細管電泳法

毛細管電泳法（CE）是對多種離子化合物進行高選擇性和高效分離的方法，在環(huán)境、法醫(yī)、食品以及生物分析等多個領(lǐng)域都有應用，其原理是根據(jù)樣品在介質(zhì)中的電遷移率不同進行分離，具有操作簡便、快速分析等特點，最常用的是毛細管區(qū)帶電泳法（CZE）。將CE與其他分析分離技術(shù)結(jié)合，多用于食品、天然產(chǎn)物等分析中，其中與質(zhì)譜法結(jié)合的分析技術(shù)應用最為普遍[18]。

生物胺是一種對人體具有傷害作用的次級代謝物，會在食品的微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生。Ad?mc?lar等[19]將樣品用三氯乙酸水溶液處理、真空過濾后，采用CE-電容耦合非接觸式CE電導檢測器（C4D）進行分析，在分離介質(zhì)pH為2.05時可以很好地從樣品中分析得到生物胺。Gatea等[20]以0.5 mol/L磷酸、0.5 mmol/L CTAB和15%甲醇為背景電解液（BGE），BGE/水（1∶1）為樣品基質(zhì)，對益生菌進行毛細管電泳分析，可以得到小鏈脂肪族有機酸和芳香族有機酸。

3.2 薄層掃描法

薄層掃描法（TLCS）是采用可見光或紫外線照射經(jīng)薄層層析的薄層色譜板，對有吸收或能產(chǎn)生熒光或能淬滅熒光的層析斑點掃描，對掃描的圖譜進行定量分析。TLCS操作簡便、樣品檢測快速，且檢測的結(jié)果準確可靠，可廣泛應用于不同領(lǐng)域中的成分分析[21]。

倪孟祥等[22]應用薄層色譜法測定南極放線菌N-I的代謝產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，得到南極放線菌N-I發(fā)酵液中的抑制劑含量為91.6%，且相對于高效液相色譜法進行初度分析的結(jié)果更為接近事實。

3.3 色譜法

色譜法在各個分析領(lǐng)域是重要的分析手段，利用樣品在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同達到分離的目的，或利用樣品與流動相或固定相之間相互作用的性質(zhì)不同，同時分離不同種類的分子。常用的色譜法分為氣相色譜法和高效液相色譜法。

3.3.1 氣相色譜法

氣相色譜法是通過將少量樣品快速蒸發(fā)為氣體，與惰性氣體混合流動進入色譜柱，由于氣相中的各組分在固定相之間的分配系數(shù)不同進行分離。該方法具有分辨率高、靈敏度高、樣品用量少、可快速分析的特點，但是操作復雜，成本高。在此基礎上發(fā)展的微氣相色譜具有生產(chǎn)和維修成本低、體積小、耗能少等優(yōu)點。

Salmerón等[23]采用頂空氣相色譜法對乳酸菌發(fā)酵谷物基質(zhì)進行分析。對發(fā)酵液進行pH調(diào)節(jié)和蒸發(fā)，收集器收集揮發(fā)性物質(zhì)并提取500 μL的頂空樣品，用檢測器進行分析，得到乳酸菌發(fā)酵物中含有揮發(fā)性風味物質(zhì)乙醛、丙酮和乙酸乙酯等，同時對這些揮發(fā)性物質(zhì)進行定量分析。

3.3.2 高效液相色譜

高效液相色譜（HPLC）是對混合物或溶解在樣品溶液中的目標成分進行分析，采用高壓液流將流動相從裝有固定相的色譜柱的一端泵入，固定相位于塔底端，另一端與加壓流動相相連接，通過流動相中目標溶質(zhì)分子與其他溶質(zhì)分子分別與固定相的相互作用性質(zhì)的不同進行分析。在氣相色譜中不能加熱的物質(zhì)可采用HPLC法分析，其具有高度敏感、高性能等特點，但不適用于某些特定的化合物。例如，Du等人[24]利用HPLC-ESI-MS/MS聯(lián)用技術(shù)可以分析橄欖小單孢菌發(fā)酵過程中氨基環(huán)己醇-氨基糖苷類生產(chǎn)途徑中產(chǎn)生的生物合成同系物，實現(xiàn)了對橄欖枝菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的10種生物合成中間體的同時分析。

3.4 質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法是利用樣品中各成分在被輻照或電離效應之后獲得更高的能量變成離子狀態(tài)，該狀態(tài)在電場和磁場的作用下，可按照質(zhì)荷比的大小進行分離，得到的質(zhì)圖譜與標準圖譜進行比較即可對化合物進行分析[25]，常與其他技術(shù)聯(lián)用。例如，可與液相色譜法聯(lián)用分析天然產(chǎn)物成分，與氣相色譜聯(lián)用檢測化合物等，同樣都具有操作簡單、快速檢測、檢測限低等優(yōu)點。李園園等[26]將從土壤中分離純化出的178株放線菌分開進行發(fā)酵，對于每株放線菌的發(fā)酵液在乙醇提取后通過HPLC-MS分析，發(fā)現(xiàn) 41株放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性。

4 結(jié)語

天然產(chǎn)物占所有治療性化合物的1/3～2/3，這些天然產(chǎn)物從自然界分離出來，部分被直接作為產(chǎn)品使用，部分作為半合成衍生物使用，并且其中約35%來源于微生物。所以微生物天然產(chǎn)物仍然是天然產(chǎn)品的重要來源，然而海洋、兩極中的低溫微生物往往被人類忽視。在天然產(chǎn)物的潛在來源中，細菌已被證明是重要來源[27]。此外，在海洋真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣化報道中，已發(fā)現(xiàn)100多種真菌可以代謝出用于藥物生產(chǎn)的活性物質(zhì)。但真正用于生產(chǎn)實踐的低溫微生物資源很少，因此加大開發(fā)與利用低溫微生物資源對人類社會的發(fā)展有積極的意義。