microRNA在乳腺癌細胞中的功能研究及其作為乳腺癌生物標志物的評估

夏赟，王清水，林堯

福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350100

乳腺癌是一種由于細胞增殖失控而引發(fā)的嚴重危及人類尤其是女性生命的疾病，每年都有大量女性因為乳腺癌病灶轉(zhuǎn)移或復發(fā)而喪生。在所有女性惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率是最高的。乳腺癌的病因與家族遺傳因素、雌激素水平、基因突變和生活方式有關[1]。由于現(xiàn)代人的飲食習慣和工作壓力，以及環(huán)境污染及各種食品添加劑等造成的激素分泌紊亂，使得乳腺癌的發(fā)病率每年呈上升趨勢。乳腺癌具有不同的腫瘤間和腫瘤內(nèi)非均勻性，并且在受影響的個體之間存在廣泛的腫瘤差異。病灶轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗和患者最終死亡的主要原因，乳腺癌細胞不斷擴散，侵襲人體其他組織器官并引起機體衰竭，最終導致死亡。雖然乳腺癌的早期診斷和檢測已經(jīng)促進了死亡率的下降，但預防、檢測和治療方面的進一步進展對于改善乳腺癌預后和生存來說仍是迫切需要的。傳統(tǒng)的乳腺癌治療方法，如手術、放療、化療和激素治療等，在早期乳腺癌的治療中具有一定的療效，但在治療后的反應或感覺、毒性和耐藥性方面不可避免地存在副作用。目前，尋找穩(wěn)定有效、非侵入的生物標志物來準確診斷乳腺癌，以及尋求新的治療乳腺癌的方法至關重要。近年來，microRNA（miRNA）因其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用而開始引起廣泛關注。

1 miRNA及其在腫瘤發(fā)生中的作用

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，最初于上世紀90年代早期在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。miRNA先通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pri-miRNA，后經(jīng)切割成有循環(huán)結(jié)構的發(fā)夾狀前體pre-miRNA，隨后運輸?shù)郊毎|(zhì)中被剪切，得到成熟的miRNA[2-4]。這些與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合的成熟的miRNA被認為可以調(diào)節(jié)至少30%的蛋白編碼基因的表達[5]。

miRNA可以促進或抑制腫瘤的發(fā)生。例如miR-372具有通過下調(diào)抑癌基因LATS2的表達來控制胃癌細胞生長、細胞周期和細胞凋亡的致癌特性[6]；膽囊收縮素B受體（CCKBR）被miR-148b靶向并顯著抑制胃癌細胞的生長[7]；miR-708-5p在非小細胞型肺癌中表達上調(diào)，并可能通過調(diào)控TMEM88促進腫瘤生長和疾病進展[8]；miR-30a-5p是非小細胞型肺癌發(fā)病機理中的關鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)非小細胞型肺癌的細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，抑制腫瘤發(fā)生[9-12]。癌癥與基因組改變之間的關聯(lián)性揭示了miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用，miRNA的異常表達同腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性相關，miRNA表達的變化會影響具有致癌或抑癌功能的靶mRNA編碼蛋白的活性，進而影響腫瘤發(fā)生進程[13-14]。此外，某些miRNA的表達水平與乳腺癌的形態(tài)學特征、免疫組化、組織病理學參數(shù)、臨床結(jié)局、預后及治療反應密切相關[15]。這些研究表明miRNA在包括乳腺癌在內(nèi)的癌癥的診斷和治療方面具有廣闊的應用前景。

2 miRNA在乳腺癌中的研究

過去幾十年，科研人員發(fā)現(xiàn)了許多在乳腺癌組織和正常組織中差異性表達的miRNA。同時，這些miRNA在乳腺癌病人和正常人的血清中的表達量有顯著性差異。在乳腺癌細胞和健康人細胞中關于miRNA的研究也得到類似結(jié)果。這些結(jié)果預示著miRNA通過腫瘤抑制和致癌的機制在乳腺癌中發(fā)揮作用[16-17]。與乳腺癌相關的miRNA通過參與復雜的調(diào)控網(wǎng)絡來調(diào)節(jié)乳腺腫瘤的某些特性，如維持生長和增殖信號、啟動轉(zhuǎn)移和入侵、抵抗凋亡、誘導血管生成、提高新陳代謝水平、支持細胞免疫逃逸等。

研究表明，miRNA通過與細胞周期蛋白家族、蛋白激酶及其抑制劑和其他生長促進因子或抑制因子的相互作用，在乳腺癌細胞的細胞周期進程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，進而影響細胞增殖水平。細胞周期對于細胞增殖的調(diào)控至關重要。健康細胞的分裂代數(shù)和數(shù)量是有限的，而細胞分裂的數(shù)量很大程度上取決于細胞在組織內(nèi)的最佳細胞密度。一旦達到一個有限的細胞密度，健康細胞將停止增殖。然而這種生理適應性的細胞周期阻滯機制在癌細胞中是異常的。Zhou等報道，miRNA模擬上調(diào)miR-143可以抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK5、絲裂原活化蛋白激酶MAP3K7和周期蛋白D1的表達，從而進一步降低乳腺癌細胞的活力，而抑制miR-143則可逆轉(zhuǎn)這些作用[18]。Wang等研究表明，miR-455過表達可通過CDC2相關蛋白激酶CDK14和周期蛋白D1表達的雙重抑制作用抑制乳腺癌細胞的增殖，并促進腫瘤抑制因子p21的表達[19]。

正常細胞的染色體或遺傳信息的破壞可導致程序性細胞死亡信號通路的誘導，即引發(fā)細胞凋亡，以此作為一種防止細胞癌變的防御機制。但即使腫瘤細胞的遺傳信息受到嚴重破壞，腫瘤細胞仍對凋亡反應具有抵抗性。細胞凋亡途徑的任何一個特定點的破壞都可能觸發(fā)乳腺細胞的惡性轉(zhuǎn)化，提高細胞活力。研究表明，miRNA可以通過靶向或啟動某些細胞凋亡途徑的特定點，在乳腺癌復雜的凋亡調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用。Sharma等發(fā)現(xiàn)促凋亡腫瘤抑制因子p53通過與miR-191-5p啟動子區(qū)域的p53響應元件結(jié)合，轉(zhuǎn)錄下調(diào)了miR-191-5p的表達。在乳腺癌細胞中，過表達miR-191-5p導致凋亡小體數(shù)量減少和caspase-3/-7活性降低，而anti-miR-191-5p逆轉(zhuǎn)了這一效應。此外，miR-191-5p水平的升高能夠下調(diào)其潛在靶基因SOX4，從而進一步降低了p53在乳腺癌細胞中的表達，提示p53-mir-191-SOX4調(diào)控反饋回路的存在[20]。

癌癥細胞具有松散的細胞基質(zhì)相互作用，與非癌癥細胞相比，它們對細胞外基質(zhì)的黏附更少，從而使它們能夠通過周圍的血液或淋巴系統(tǒng)入侵或轉(zhuǎn)移。研究表明，影響乳腺癌轉(zhuǎn)移和細胞侵襲的某些miRNA的活性是由FOXP3和KAT2B誘導的。Zhang等發(fā)現(xiàn)，miR-200家族的2個成員，miR-200c和miR-141，都是由FOXP3誘導的，而KAT2B起協(xié)調(diào)作用[21]。隨著腫瘤病情的發(fā)展，腫瘤會迅速擴展到現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)之外，并導致形成一個比健康組織氧濃度低的腫瘤微環(huán)境，而這種腫瘤微環(huán)境是乳腺癌血管生成的關鍵調(diào)控因子。乳腺腫瘤的持續(xù)增殖和生長會引發(fā)新血管生成，從而為腫瘤提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，促進腫瘤進一步發(fā)展。miR-210是缺氧時最一致和最顯著的誘導miRNA，Camp等對乳腺癌細胞進行了缺氧過程miRNA測序數(shù)據(jù)分析，檢測到miR-210-3p 的上調(diào)[22]。

還有一些miRNA被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中發(fā)揮作用。例如，miR-99a既是癌基因FGFR3的調(diào)節(jié)因子，也是導致乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移顯著減少的腫瘤抑制因子，血清miR-99a水平與臨床結(jié)果相關[23]。此外，據(jù)報道m(xù)iR-9與乳腺癌的復發(fā)和不良預后密切相關，也是乳腺癌診斷和預后的有前途的生物標志物。Bertoli等回顧了與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展有關的miRNA，并證實miR-9正在成為乳腺癌診斷和預后的生物標志物[24]。Sporn等通過分析來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的985例乳腺癌的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-9低表達似乎具有保護作用[25]。Li等報道，miR-29c通過靶向DNMT3B參與抑制乳腺癌的進展[26]。miR-196a被確定為通過靶向UBE2C來促進乳腺癌細胞生長[27]。除此之外，還有許多miRNA被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的發(fā)生有關。開發(fā)基于miRNA的新的生物療法，可以為乳腺癌的治療提供新的思路和方法。

3 miRNA作為乳腺癌生物標志物

由于miRNA與癌癥發(fā)生相關，因此人們正在尋求miRNA標記作為新的臨床診斷靶標，以進一步對乳腺癌進行分型，并預測轉(zhuǎn)移或治療耐藥性。miRNA作為生物標志物靶標的潛力得益于其在血液中的穩(wěn)定性，以及其承受反復冰凍和解凍循環(huán)的能力[28]。Iorio等發(fā)現(xiàn)miRNA-10b在晚期乳腺癌中表達水平較高，可作為乳腺癌的檢測指標[29]。Biagioni等發(fā)現(xiàn)miRNA-10b基因位于染色體2q31.1上的同源盒D10（HOXD10）基因簇上，位于HOXD-4和HOXD-8之間的間隔中[30]。Ohuchi?da等提出miRNA-10b的主要靶基因HOXD10可以抑制多種實體瘤的轉(zhuǎn)移[31]。與健康人相比，miRNA-10b水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性乳腺導管癌患者的血液循環(huán)中顯著增加，提示miRNA-10b可以作為檢測乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標志物[32]。在循環(huán)腫瘤細胞（CTC）患者中發(fā)現(xiàn)8種miRNA（miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-210、miR-375 和 miR-801）顯著升高[33]。在另一項研究中，與未轉(zhuǎn)移的乳腺癌相比，早期轉(zhuǎn)移的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了更高水平的miR-105[34]。研究還發(fā)現(xiàn)過表達miR-105可促進體內(nèi)轉(zhuǎn)移。miR-17和miR-155被認為是轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在鑒別因子[35]。這些miRNA中的許多已經(jīng)在轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌樣本中被識別為標記物，突顯了miRNA作為區(qū)分非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的生物標志物的重要性和潛在應用價值。目前，利用miRNA作為生物標志物進行可靠的臨床檢測仍然存在困難，還須深入的研究。

4 miRNA在乳腺癌診斷和治療中的前景

使用miRNA進行癌癥治療的最大優(yōu)勢之一是它可以靶向涉及相似途徑的多個基因[36]。以miRNA為靶點的治療策略可能成為一種新的多途徑的腫瘤治療策略。例如，基于miR-9在乳腺癌中表達的特異性及其進入體液循環(huán)和穩(wěn)定性的能力，可以檢測人血、尿或膽汁中的miR-9水平，作為一種潛在的無創(chuàng)乳腺癌腫瘤標志物[24]。此外，基于miR-9的藥物也是一種有前途的乳腺癌治療方法。為了使miRNA在包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的治療領域中更加成功，目前科學家正在探索改變合成miRNA的方法，例如通過改變某些結(jié)構元件，以便使其在體內(nèi)更容易地轉(zhuǎn)移至宿主細胞[37]。目前離miRNA能夠?qū)嶋H應用到乳腺癌臨床治療和藥物研發(fā)階段還有一定的距離，基于miRNA的治療方式和診斷方法被充分利用之前仍然存在諸多困難和挑戰(zhàn)，因此還需要更多科研人員的努力。