雙陰性T細(xì)胞在惡性腫瘤中的治療機(jī)制及其臨床應(yīng)用進(jìn)展

孫克娜綜述，陳英劍審校

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250031；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東 濰坊 261053

惡性腫瘤是人類死亡的主要原因，人口的快速增長和社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展使我國的腫瘤發(fā)生率處于高水平且不斷增長[1-2]。目前大多數(shù)惡性腫瘤早期臨床癥狀隱匿，惡性程度高，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，手術(shù)根治率低，預(yù)后較差。因此，提高腫瘤患者生存率的關(guān)鍵是早診斷早治療和探索新的治療途徑。現(xiàn)階段用于臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是病理學(xué)檢查，但因檢查費(fèi)用昂貴，對患者和醫(yī)師要求高，其輔助手段可能會出現(xiàn)穿孔、出血等不良反應(yīng)，無法用于大規(guī)模初篩[3]。人們在探索治療新方法的道路上逐漸認(rèn)識到免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別、發(fā)生發(fā)展和殺傷起重要作用，腫瘤免疫療法也隨之成為研究熱點(diǎn)。雙陰性T細(xì)胞（double negative T cells，DNT）是近年發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，屬于T淋巴細(xì)胞亞群，根據(jù)抗原受體組成的不同分為αβT和γδT兩群，其表面既不表達(dá)CD4也不表達(dá)CD8，但可通過免疫抑制調(diào)節(jié)功能殺傷腫瘤細(xì)胞，在機(jī)體抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。我們在此簡要概述DNT細(xì)胞在腫瘤免疫調(diào)控和臨床應(yīng)用領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，旨在進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展和遷移的機(jī)制，為臨床應(yīng)用拓寬道路。

1 DNT細(xì)胞的來源

T細(xì)胞在胸腺發(fā)育過程中經(jīng)歷了陽性選擇和陰性選擇,只有以適當(dāng)T細(xì)胞受體（T cell recep?tor，TCR）親和力發(fā)生特異性結(jié)合才能分化為CD4+或CD8+T細(xì)胞，TCR親和力過高可能有助于雙陽性T細(xì)胞（double positive T cells，DPT）逃離陰性選擇最終發(fā)育為DNT細(xì)胞[4]。但有學(xué)者認(rèn)為DNT細(xì)胞在特定條件下可以直接來源于CD4+或CD8+T細(xì)胞。Zhao等[5]發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞凋亡受損時(shí)，增殖的CD4+T細(xì)胞在共刺激復(fù)合物OX40（CD134）/OX40L的輔助下可直接轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性DNT細(xì)胞以維持外周免疫耐受，轉(zhuǎn)化得到的DNT細(xì)胞表現(xiàn)出高度抗原特異性，可降低免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的組織損傷。孫廣永等[6]也發(fā)現(xiàn)OX40/OX40L能夠抑制DNT細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化效率，提高其免疫抑制功能。另外，體外活化成熟的鼠CD8+T細(xì)胞在高劑量白細(xì)胞介素4（IL-4）的刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)镈NT細(xì)胞；體內(nèi)TCR刺激的CD8+T細(xì)胞可導(dǎo)致DNT細(xì)胞的初始積累[7]。以上結(jié)果表明，當(dāng)體內(nèi)外免疫條件發(fā)生改變時(shí)，不同種類的T細(xì)胞可直接或間接通過多種途徑衍生為DNT細(xì)胞。隨著對T淋巴細(xì)胞亞群研究的不斷深入，現(xiàn)已明確調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有多種不同的細(xì)胞亞型，但DNT細(xì)胞的來源及其內(nèi)在轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不完全明晰，主要原因在于不同的DNT細(xì)胞可以表達(dá)不同的表面標(biāo)志。

2 DNT細(xì)胞在腫瘤治療中可能存在的調(diào)控機(jī)制

2.1 DNT細(xì)胞通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

表達(dá)Fas的靶細(xì)胞與FasL結(jié)合后，活化并傳遞凋亡信號，誘導(dǎo)靶細(xì)胞進(jìn)入死亡程序，維持著人體細(xì)胞凋亡與增殖的平衡，對機(jī)體殺傷腫瘤細(xì)胞起到了重要的促進(jìn)作用[8]。胡丕波等[9]采用ELISA方法在DNT細(xì)胞上清液中檢測出可溶性FasL（sFasL）高表達(dá)。Lu等[10]將DNT細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞Panc-1共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞對Panc-1細(xì)胞具有殺傷作用且呈劑量依賴型，進(jìn)一步采用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)Panc-1細(xì)胞表面Fas表達(dá)上調(diào)，與Chen等[11]關(guān)于DNT細(xì)胞可抑制胰腺癌生長的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果充分說明了DNT細(xì)胞可通過分泌sFasL與胰腺癌細(xì)胞表面的Fas特異性結(jié)合介導(dǎo)殺傷胰腺癌細(xì)胞。

2.2 DNT細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子作用于腫瘤細(xì)胞

陳炯等[12]發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者DNT細(xì)胞數(shù)量與γ干擾素（IFN-γ）含量呈正相關(guān)，分泌的IFN-γ隨著DNT細(xì)胞數(shù)量的減少而減少，IFN-γ的降低影響了機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的抗腫瘤作用，這可能與DNT細(xì)胞大量分泌IFN-γ有關(guān)。同時(shí)，DNT細(xì)胞的數(shù)量與IL-4含量呈負(fù)相關(guān)，多數(shù)研究已經(jīng)表明DNT細(xì)胞不分泌IL-4，這可能與DNT細(xì)胞抑制其他免疫細(xì)胞使得分泌IL-4含量下降有關(guān)?，F(xiàn)已明確，IL-2可增強(qiáng)DNT細(xì)胞對凋亡的抵抗力及其增殖能力[13]；IFN-γ通過促進(jìn)DNT細(xì)胞表達(dá)高水平NKG2D和DNAM-1，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對DNT細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性的敏感性[14]。

2.3 DNT細(xì)胞通過DNAM-1和NKG2D及其配體途徑作用于腫瘤細(xì)胞

DNAM-1和NKG2D都是細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的主要活化受體，在CD8+和CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DNT細(xì)胞上均有表達(dá)。Lee等[14]認(rèn)為IFN-γ可通過誘導(dǎo)NKG2D配體在急性髓細(xì)胞白血病（AML）細(xì)胞中高表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對DNT細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性更加敏感，高效發(fā)揮DNT細(xì)胞的抗腫瘤活性。Lee等[15]在腫瘤免疫治療中充分證明了通過低劑量硼替佐米來提高NKG2D配體的表達(dá)是一種有前途的治療策略。Kearney等[16]發(fā)現(xiàn)，在缺乏DNAM-1配體的情況下，T淋巴細(xì)胞亞群對腫瘤的殺傷作用明顯減弱，而CD112和CD155的表達(dá)是DNAM-1依賴性殺傷AML細(xì)胞所必需的。這與Sanchez-Correa等[17]所證明的DNAM-1是與靶細(xì)胞中的CD112和CD155相互作用后參與T淋巴細(xì)胞亞群殺傷活性共受體的研究結(jié)果相一致。由此可見，T淋巴細(xì)胞亞群DNAM-1受體表達(dá)降低可能是腫瘤逃逸的另一種機(jī)制。

2.4 DNT細(xì)胞通過TRAIL通路作用于腫瘤細(xì)胞

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）通路的抗腫瘤作用受到了國內(nèi)外學(xué)者的重視。趙越[18]等通過檢測DNT細(xì)胞培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)了DNT細(xì)胞可分泌可溶性TRAIL（sTRAIL），隨后采用免疫組化法觀察到TRAIL-R1在胰腺癌癌旁組織中高表達(dá)，在胰腺癌組織中的表達(dá)相對較少，在高分化胰腺癌組織中的表達(dá)高于低分化組織。這說明受體TRAIL-R表達(dá)下調(diào)后，同TRAIL結(jié)合減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Tawfik等[19]通過胰腺導(dǎo)管腺癌Colo357細(xì)胞與γδT細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的裂解不受抗TRAIL抗體或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的抑制，但TRAIL-R4會使γδT細(xì)胞分泌顆粒酶B減少而環(huán)加氧酶（COX）2的表達(dá)水平升高，增強(qiáng)γδT細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性。這說明DNT細(xì)胞抗腫瘤通路之間相互調(diào)節(jié)、相互作用，為調(diào)控機(jī)制的研究增加了難度。

3 DNT細(xì)胞的臨床應(yīng)用

3.1 DNT細(xì)胞在腫瘤診斷中的應(yīng)用

隨著對DNT細(xì)胞作用機(jī)制研究的不斷深入，DNT細(xì)胞的臨床價(jià)值越來越受到重視。在老年晚期結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)，化療前患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)明顯低于健康組，而化療后T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)明顯升高[20]。這說明患者治療前存在明顯的免疫抑制狀態(tài)，治療前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化對機(jī)體免疫狀態(tài)的反映具有重要的臨床意義和指導(dǎo)作用。B16F10黑色素瘤小鼠體內(nèi)DNT細(xì)胞數(shù)量升高且與腫瘤大小呈正相關(guān)[21]；肺癌患者和結(jié)直腸癌患者外周血中DNT細(xì)胞數(shù)量均顯著增高[22]。胡小倩等[23]在肺腫瘤、乳腺腫瘤、胃腫瘤、肝腫瘤和腸道腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組外周血CD4+/CD8+比值均明顯低于同種良性腫瘤組，DNT細(xì)胞比例均明顯高于同種良性腫瘤組。我們可以初步認(rèn)定DNT細(xì)胞比例在惡性腫瘤中呈升高趨勢，提示其是一種潛在的診斷指標(biāo)。但DNT細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不明確，因此，我們無法知悉DNT細(xì)胞在惡性腫瘤患者體內(nèi)是抑制免疫功能、殺傷腫瘤細(xì)胞還是保護(hù)機(jī)體免疫功能。同時(shí)，對于惡性腫瘤患者DNT細(xì)胞的這種變化是否只是一種代償機(jī)制或其他原因，有待于進(jìn)一步探討和證實(shí)。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，單個(gè)腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性偏低，往往不能滿足臨床需要。因此，將特異性和相關(guān)性較好的幾種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合起來檢測，對提高腫瘤的早期診斷有重要價(jià)值。有研究發(fā)現(xiàn)[24]，聯(lián)合檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群、DNT細(xì)胞和血清癌胚抗原（CEA）可將肺癌檢出的靈敏度、特異度分別提高至90.8%和98.9%。由此可見，與CEA的聯(lián)合診斷具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。徐志全等[25]通過回顧性分析92例經(jīng)根治術(shù)治療的直腸癌患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)前T淋巴細(xì)胞亞群與CEA雙陽患者的五年生存率最低。通過監(jiān)測惡性腫瘤患者T淋巴細(xì)胞亞群及DNT細(xì)胞的表達(dá)，將進(jìn)一步評估患者的抗腫瘤免疫功能，進(jìn)而為診斷腫瘤、判斷患者預(yù)后及設(shè)計(jì)更為切實(shí)可行的治療方案提供理論依據(jù)，且方法簡便易行，今后有望在基層醫(yī)院得到深入開展。

3.2 DNT細(xì)胞在腫瘤治療中的應(yīng)用

幾十年來，鉑類化療是治療晚期腫瘤惟一有效的全身療法，但化療患者生存率低，僅8～10個(gè)月。利用宿主免疫應(yīng)答來治療癌癥的免疫療法成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，抗PD-1免疫檢查點(diǎn)阻斷法（ICB）已獲準(zhǔn)用于臨床治療，但并非對所有腫瘤患者都有效。Fang等[26]發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)DNT細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移顯著抑制晚期肺癌移植瘤的生長，提高了受體小鼠的存活率；在體外離體擴(kuò)增的DNT細(xì)胞對肺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。而在肺組織中DNT細(xì)胞可通過分泌高水平IL-10和IFN-γ發(fā)揮對正常肺細(xì)胞的保護(hù)功能[27]。上述結(jié)果充分說明DNT細(xì)胞的過繼性細(xì)胞治療是很有前途的治療方案。在腫瘤異種移植模型中，抗PD-1可以增加細(xì)胞毒性DNT細(xì)胞的積累，進(jìn)一步增強(qiáng)DNT細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤功能。DNT細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合抗PD-1過繼細(xì)胞治療肺癌具有重要的臨床意義。同時(shí)，研究證明DNT細(xì)胞的過繼性細(xì)胞治療對肝癌患者也具有重要的臨床價(jià)值[28]。

化療耐藥是臨床治療晚期腫瘤所面臨的巨大挑戰(zhàn)，目前已發(fā)現(xiàn)有多種形式的細(xì)胞療法可用來解決這一難題，但功效低和毒性大阻礙了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，在體外，健康供體來源擴(kuò)增的DNT細(xì)胞可以靶向原代AML細(xì)胞，其中包括9例對化療耐藥的患者標(biāo)本。更重要的是，同種異體DNT細(xì)胞不會影響正常造血細(xì)胞功能和造血干/祖細(xì)胞移植及分化，也不會在受體中引起異種移植物抗宿主病[14,29]。Yao等[30]發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的DNT細(xì)胞能夠有效地靶向大量非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，并在體內(nèi)抑制肺癌的生長，而IL-15的加入可以增強(qiáng)DNT細(xì)胞的抗腫瘤作用，這是因?yàn)镮L-15可以上調(diào)DNT細(xì)胞識別腫瘤的先天性受體，DNT細(xì)胞與IL-15聯(lián)用可進(jìn)一步緩解機(jī)體化療耐藥。上述研究說明DNT細(xì)胞免疫療法對治療靶向化療耐藥和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)具有充分的可行性，但DNT細(xì)胞在腫瘤中的作用機(jī)制尚不完全明確，這也為推動臨床廣泛應(yīng)用增加了難度。

4 結(jié)語

當(dāng)機(jī)體發(fā)生癌變時(shí)，免疫系統(tǒng)會及時(shí)做出反應(yīng)。雖然，有研究報(bào)道DNT細(xì)胞在腫瘤診斷和過繼免疫治療中具有可行性，但下一步需要擴(kuò)大樣本量，對DNT細(xì)胞的臨床價(jià)值進(jìn)行充分驗(yàn)證。另外，目前的研究大多源于動物模型，相對于復(fù)雜的人體系統(tǒng)來說，將DNT細(xì)胞的理論研究應(yīng)用于臨床仍有許多問題亟待解決。DNT細(xì)胞免疫調(diào)控途徑之間存在相互調(diào)節(jié)、相互制約，這為研究免疫治療調(diào)控機(jī)制帶來挑戰(zhàn)。深入探討DNT細(xì)胞與腫瘤免疫之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展及遷移機(jī)制，從而有利于提高DNT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，增強(qiáng)機(jī)體的反應(yīng)性，為DNT細(xì)胞臨床免疫治療及預(yù)后評估提供新方案。