四川不同地區(qū)的熟醋及其固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化分析

劉廷銳，張超，朱文優(yōu)，*，凌生隆

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000；3.四川省宜賓市思坡醋業(yè)有限責(zé)任公司，四川宜賓644000）

四川麩醋是我國(guó)四大名醋之一[1]，其以生麥麩為主要原料[2]、以中草藥醋曲為發(fā)酵劑、采用“糖化、酒化、醋化”三化同池發(fā)酵的獨(dú)特工藝釀制而成。四川麩醋色澤紅棕[3-4]、味道幽香、酸味柔和、體態(tài)澄清[5-6]，具有促進(jìn)鈣和鐵吸收、降脂減肥、防治動(dòng)脈硬化和美容養(yǎng)顏等諸多功能性作用[7]。

食醋的風(fēng)味品質(zhì)不僅受生產(chǎn)原料及工藝條件的影響，其產(chǎn)地的地理氣候條件也會(huì)對(duì)食醋的風(fēng)味產(chǎn)生影響[8]。有機(jī)酸是食醋中主要的風(fēng)味物質(zhì)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)鎮(zhèn)江香醋和山西老陳醋的有機(jī)酸含量進(jìn)行了大量研究[9-10]，對(duì)四川麩醋的研究卻鮮有報(bào)道。余永建等[11]對(duì)市面上來(lái)自鎮(zhèn)江、上海和北京等50 種熟醋中的有機(jī)酸進(jìn)行分析，但是并未包含四川麩醋。熊越等[12]對(duì)四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化進(jìn)行聚類分析，將發(fā)酵過(guò)程分為6 個(gè)階段，但并未將四川麩醋與其它食醋做橫向?qū)Ρ确治?。本試?yàn)以四川宜賓思坡醋廠固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的醋醅和市面上14 種不同產(chǎn)地的四川麩醋以及8 種外地典型代表食醋作為研究對(duì)象，運(yùn)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography ，HPLC）分析麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化和不同地區(qū)熟醋有機(jī)酸含量的差異，為進(jìn)一步研究四川麩醋的風(fēng)味物質(zhì)提供依據(jù)，為后期構(gòu)建四川麩醋指紋圖譜推動(dòng)產(chǎn)業(yè)升級(jí)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋醅采集于四川宜賓思坡醋廠且取樣方法一致，分別采集同一發(fā)酵批次過(guò)程中的第 1、3、5、7、9、12、14、16、18、21、23 天且于-20 ℃溫度下冷藏保存。22 種來(lái)自不同地區(qū)不同廠家的典型食醋均為市售，樣品相關(guān)信息見(jiàn)表1。

甲醇（色譜純）、硫酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸均為標(biāo)準(zhǔn)品：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。

表1 22 種熟醋醋樣的相關(guān)信息Table 1 22 kinds of cooked vinegar-like information

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀Agilent 1220 infinity LC：美國(guó)安捷倫公司；色譜柱 Target-H（7.8×300 mm，10 μm）、預(yù)處理柱C18 SPE Cartridge：美國(guó)MS 科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理方法

對(duì)液態(tài)食醋，取10 mL 醋樣于100 mL 容量瓶中，加入2 mL 亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和2 mL 硫酸鋅溶液（300 g/L），搖勻后用超純水定容。靜置沉淀30 min，移取上清液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，然后用C18 固相萃取小柱處理后上樣分析[13]。

對(duì)固態(tài)醋醅，稱取50 g 醋醅，加150 mL 超純水浸泡3 h，過(guò)濾，取濾液10 mL 并加入1 mL 亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和 1mL 硫酸鋅溶液（300 g/L），用超純水定容至50 mL，混勻靜置沉淀30 min，移取上清液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，然后用C18 固相萃取小柱處理后上樣分析[14-15]。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Target-H 離子交換柱（7.8×300 mm，10 μm），流動(dòng)相：10 mmol/L 稀硫酸，流速：0.6 mL/min，柱溫：58 ℃。進(jìn)樣體積 10 μL，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm[16]。

1.3.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL 容量瓶中，用超純水溶解并定容，保存于4 ℃冰箱中?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的濃度見(jiàn)表2。

分別取不同體積（0、10、20、50、75、100 μL）的混標(biāo)用超純水定容于10 mL 容量瓶中混勻，得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)[17]。

1.3.4 方法的精密度和重現(xiàn)性

選擇鎮(zhèn)江香醋作為醋樣經(jīng)過(guò)前處理后重復(fù)進(jìn)樣5次以測(cè)定方法的重現(xiàn)性。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[18-19]。

表2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品配置濃度Table 2 Organic acid standard configuration concentration

1.3.5 方法的回收率

選擇鎮(zhèn)江香醋作為醋樣制作兩個(gè)一樣的樣品，一份加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，一份不加，然后經(jīng)過(guò)相同的預(yù)處理等步驟上樣分析，計(jì)算其加標(biāo)回收率[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析方法

根據(jù)每個(gè)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和出峰面積，計(jì)算樣品中對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸的含量。采用The unscramble9.7軟件對(duì)樣品中的有機(jī)酸含量情況進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)酸分析的方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相圖譜如圖1 所示。

由圖1 可知，各有機(jī)酸分離良好。通過(guò)峰面積外標(biāo)法定量，得到各有機(jī)酸的峰面積-濃度曲線及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

通過(guò)表3 可知，各有機(jī)酸相關(guān)系數(shù)R2>0.999，線性范圍良好，可以用于樣品定量分析。

2.1.2 方法重現(xiàn)性結(jié)果

方法重現(xiàn)性結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1 混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chart of mixed organic acid standard solution

表3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)Table 3 Linear parameters of organic acid standard curve

表4 方法重現(xiàn)性結(jié)果Table 4 Method reproducible result mg/mL

通過(guò)表4 可知，相對(duì)偏差在1.79%～6.33%，重現(xiàn)性較好。

2.1.3 樣品加標(biāo)回收率

樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品加標(biāo)回收率結(jié)果Table 5 Sample spike recovery result mg/mL

從表5 可以看出，樣品的加標(biāo)回收率為102.07%～109.47%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確率較高，適用于有機(jī)酸的檢測(cè)分析。

2.2 不同地區(qū)食醋中有機(jī)酸含量差異分析以及四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化分析

2.2.1 有機(jī)酸的分析結(jié)果

對(duì)來(lái)自11 個(gè)不同地區(qū)的22 種醋樣中有機(jī)酸含量以及四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量變化進(jìn)行分析，并根據(jù)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表6。

從表6 中可知，在熟醋中和醋醅固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，乙酸都是其含量最高的酸，占總有機(jī)酸58.12%，而含量次之的是乳酸，占總有機(jī)酸32.67%。這兩種酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它幾種有機(jī)酸[21-22]。在熟醋中，不同品種的食醋有機(jī)酸含量差別也較明顯，如S1 中乙酸含量為5.031 7 mg/mL，而S14 的乙酸含量卻只有1.776 8 mg/mL。又比如S1 中乳酸的含量為3.345 1 mg/mL，而S17 中的乳酸含量只有0.276 mg/mL。在四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其中草酸和檸檬酸變化不顯著，酒石酸和蘋(píng)果酸略有降低，琥珀酸先升高在降低，而其中乙酸由1.271 2 mg/mL 升高至3.121 4 mg/mL，乳酸由0.885 8 mg/mL 升高至1.321 6 mg/mL，它們相較與其它幾種有機(jī)酸含量變化較為顯著。

2.2.2 有機(jī)酸主成分分析結(jié)果

2.2.2.1 對(duì)熟醋中有機(jī)酸主成分分析

對(duì)熟醋中有機(jī)酸含量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖2（a）為分?jǐn)?shù)二維散點(diǎn)圖，該圖可用于解釋樣本之間的差異和相似性，樣本越接近，它們與相關(guān)的兩個(gè)組件越相似。相反，遠(yuǎn)離彼此的樣品彼此不同。圖2（b）為x-變量的加載二維散點(diǎn)圖，該圖對(duì)于解釋X 數(shù)據(jù)中的最大變化，顯示了指定的兩個(gè)因子的不同變量的重要性。

表6 不同地區(qū)的醋樣以及四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中7 種有機(jī)酸含量Table 6 Vinegar in different regions and 7 kinds of organic acids in solid fermentation process of Sichuan bran vinegar mg/mL

從圖2（a）中可以看出，所有散點(diǎn)相聚不遠(yuǎn)，顯示了食醋相似性，而其中S3～S14 這12 種四川麩醋尤為集中，顯示了四川麩醋之間的關(guān)聯(lián)性。它們都分布在PC2 的正方向上，且具有較高的載荷，結(jié)合圖2（b）分析可以得出四川麩醋與乳酸相關(guān)聯(lián)，這表明乳酸可以將四川麩醋與其地域的食醋有效的區(qū)分開(kāi)，再根據(jù)表6 可以得出四川麩醋中的乳酸明顯高于其它地域的樣品。在圖2（a）和圖2（b）中可以看出同為四川麩醋的S1 和S2 兩種保寧醋在PC1 的正方向上有較高的載荷，它們和乙酸具有一定的關(guān)聯(lián)性，結(jié)合表6 說(shuō)明保寧醋中乙酸含量較突出。

2.2.2.2 對(duì)四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸主成分分析

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 熟醋主成分分析結(jié)果Fig.2 Finished vinegar principal component analysis results

圖3 四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸主成分分析結(jié)果Fig.3 Principal component analysis of organic acids during solidstate fermentation of Sichuan bran vinegar

圖3（a）顯示了3 d～10 d 具有相似性，12 d～18 d 具有相似性，21 d～23 d 具有相似性，由此可以把發(fā)酵過(guò)程大致分為4 個(gè)部分，第一部分1 d～2 d，第二部分3 d～10 d，第三部分 11 d～19 d，第四部分 20 d～23 d。圖3（a）顯示第二部分3 d～10 d 在PC2 的正方向上具有較高的載荷，結(jié)合圖3（b）可知發(fā)酵過(guò)程3 d～10 d 這個(gè)階段與乳酸具有較高的關(guān)聯(lián)性，表明乳酸可以作為這個(gè)階段特征有機(jī)酸可以區(qū)分開(kāi)發(fā)酵過(guò)程中其它階段。結(jié)合表6 可知，此階段乳酸含量較之前顯著增高，然后開(kāi)始降低，這可能是固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中初始糖化和酒化階段，該階段乳酸菌大量繁殖產(chǎn)生大量乳酸[23-24]，然后進(jìn)入醋酸發(fā)酵階段，該階段乙酸含量大量增加[25-27]。圖3（a）可以看出在12 d～23 d 在PC1 的正方向上具有較高的載荷，結(jié)合圖3（b）可知，該階段與乙酸相關(guān)聯(lián)，表明乙酸可以將這個(gè)階段與其它階段區(qū)分開(kāi)，結(jié)合表6 可知，該階段乙酸含量顯著增高，這可能是前期和這個(gè)階段中醋酸發(fā)酵乙酸的持續(xù)積累和后熟階段少量乳酸被用作碳源轉(zhuǎn)化為乙酸的結(jié)果[28-30]。

3 結(jié)論

以22 種熟醋和發(fā)酵過(guò)程中四川麩醋醋醅作為研究對(duì)象，對(duì)樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析，通過(guò)結(jié)果可知在醋醅固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，乙酸是其含量最高的酸，占總有機(jī)酸58.12%，而含量次之的是乳酸，占總有機(jī)酸32.67%。在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，7 種有機(jī)酸中乙酸和乳酸變化最為顯著，其它有機(jī)酸較之變化相對(duì)不明顯。對(duì)結(jié)果進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，在熟醋中，乳酸對(duì)四川麩醋顯示了較高的相關(guān)性，乳酸的含量明顯高于其它地區(qū)的食醋，這表明乳酸可以將四川麩醋與其地域的食醋有效的區(qū)分開(kāi)。在四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期與乳酸具有關(guān)聯(lián)性，乳酸含量變化顯著，這可能是前期糖化酒化階段，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸。后期與乙酸具有相關(guān)性，乙酸含量顯著升高，這可能是醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生持續(xù)產(chǎn)生乙酸積累和后期用乳酸作為碳源產(chǎn)生乙酸的結(jié)果。本研究為闡明四川麩醋的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后期構(gòu)建四川麩醋指紋圖譜提供理論支持。