金鯧魚骨明膠的提取工藝及性質研究

于淑池，賴卓慧

（海南熱帶海洋學院海南省海洋食品工程技術研究中心，海南三亞572022）

明膠來源于動物的骨、皮膚等結締組織中的膠原蛋白，是膠原纖維經(jīng)處理后，具有高結晶度的纖維晶體結構被破壞，其氫鍵斷裂，螺旋結構被打開而得到的水解產(chǎn)物[1-2]。市售明膠主要是由陸棲動物的皮和骨骼制備而成[3]。由于明膠市場需求的擴大[4]，加之哺乳動物疾病頻發(fā)，研究者[5-9]開始從水產(chǎn)品源提取明膠，魚骨中蛋白含量達到30%，且主要為膠原蛋白，是獲取明膠的良好原料[10]。金鯧魚（golden pompano），學名卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus），地方名稱黃臘鯧，金鯧，屬硬骨魚綱、鱸形目、鯧鲹屬[11]，是我國南方沿海重要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一[12]，從2005 年以來，金鯧魚的加工制品產(chǎn)量逐步升高，比例占金鯧魚總產(chǎn)量的50%～80%[13]。2016 年，我國金鯧魚產(chǎn)量約為 15 萬 t[14]，產(chǎn)業(yè)鏈逐步完善，產(chǎn)業(yè)價值巨大。隨著金鯧魚需求量的大量增加，加工過程中有大量魚頭、魚骨等副產(chǎn)物產(chǎn)生，且基本都沒有被開發(fā)利用[15]，這不僅造成了水產(chǎn)資源的浪費，還產(chǎn)生了一定的環(huán)境污染。廖偉等[16]利用酶法金鯧魚魚皮中提取膠原蛋白，但金鯧魚骨明膠的提取工藝還未見報道。從金鯧魚骨中提取明膠可以替代部分哺乳類明膠，同時減少了環(huán)境污染，使金鯧魚加工下腳料變廢為寶。

目前骨明膠的提取主要采用傳統(tǒng)的浸灰工藝及現(xiàn)代生物酶法[17]。浸灰工藝提取的明膠，存在好膠率低、能耗大、耗水量大等諸多缺點[18]。生物酶法工藝制得的明膠具有質量高、生產(chǎn)周期短、廢水量低等優(yōu)勢，成為骨膠和皮膠工業(yè)的發(fā)展方向[19]。酶法提取明膠所用到的蛋白酶有木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等，不同的蛋白酶作用位點不一樣。木瓜蛋白酶作用于肽鍵而催化蛋白質水解, 同時具有較高的遇熱穩(wěn)定性[20]，因此本研究采用木瓜蛋白酶酶解金鯧魚加工下腳料中的魚骨，提取骨明膠，并對提取的明膠產(chǎn)品的相關性能進行測定，研究結果可以為金鯧魚魚骨等下腳料的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金鯧魚：三亞市勝利廣場旺豪超市；木瓜蛋白酶（食品級，初始酶活20 萬U/g）：河南三化生物科技有限公司：色拉大豆油（食品級）：廣州市金晨油脂有限公司；石油醚（60 ℃～90 ℃）、95%乙醇、36%冰乙酸、氫氧化鈉（分析純）、十二烷基硫酸鈉（化學純）：西隴科學股份有限公司；乙酸鎂（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；硫酸銅、硫酸鉀（分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

超級恒溫水浴槽（HWS-26）：金壇市盛藍儀器制造有限公司；質構儀（TMS-Pro）：美國Food Technology Corporantion 公司；電熱套（PTHW）：鞏義市予華儀器責任有限公司；旋轉黏度計（NDJ-8S）：上海平軒科學儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)器（RE-52）：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-B95）：鄭州長城貿(mào)有限公司；電子天平（ME204E/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；精密可編程熱風循環(huán)烘箱（LTDBX120F）：立德泰勀（上海）科學儀器有限公司；高速分散器（XHF-DY）：寧波新芝生物股份有限公司；pH計（PB-10）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；多功能粉碎機（RS-FS1401）：合肥榮事達小家電有限公司；馬弗爐（HLX-12B）：洛陽恒立窯爐有限公司；真空冷凍干燥機（Pilot-12E）：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；紫外可見分光光度計（TV-1900 雙光束）：北京普析通用儀器有限責任公司；傅立葉紅外光譜儀（Nicoletnexos 型）：美國 Nicolet 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金鯧魚骨明膠的提取工藝流程

金鯧魚→預處理（去內(nèi)臟、皮、肉）→魚骨清洗→烘干打粉→石油醚脫脂→木瓜蛋白酶酶解→高溫滅酶→水浴提取→真空抽濾濃縮→冷凍干燥→明膠成品

操作要點：金鯧魚洗凈，沿魚尾剖至魚頭，將魚肉連同魚皮切出，去掉內(nèi)臟及魚骨上的碎肉，反復用自來水清洗至魚骨無雜質。60 ℃烘箱中干燥至魚骨無水，打粉，魚骨粉在石油醚作用下回流6 h～8 h 充分脫脂。稱?。?±0.01）g 脫脂魚骨粉放至錐形瓶中，按著1 ∶6（g/mL）的比例加入蒸餾水，采用木瓜蛋白酶在一定溫度、pH 值下對脫脂魚骨粉酶解一定時間，99 ℃的高溫下條件下對木瓜蛋白酶進行滅酶20 min[7]，滅酶結束后放在水浴鍋中設置65 ℃水浴加熱3 h 提取明膠。進行抽濾，濾過液在60 ℃、真空度高于6.666×105Pa條件下濃縮到20%[8]。置于-40 ℃的條件下預先的冷凍12 個h，在10 Pa 壓力下的真空冷凍干燥8 h[21]，得到金鯧魚骨明膠成品。

1.3.2 金鯧魚骨基本成本測定

對經(jīng)過預處理的金鯧魚骨的水分、粗脂肪、粗蛋白、灰分這4 個基本成分進行測定，其中水分按照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[22]中的直接干燥法、粗脂肪按照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[23]中的索氏抽提法、粗蛋白按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[24]中的凱氏定氮法、灰分按照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[25]中的方法，各平行3 次測定，結果取平均值。

1.3.3 金鯧魚骨明膠提取的單因素試驗

選擇酶添加量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH 值4個因素，以明膠提取率為評定指標，進行單因素試驗，確定最佳工藝條件。明膠提取率的計算公式為：

式中：m1為干燥明膠成品，g；m2為脫脂金鯧魚骨粉，g。

1.3.4 金鯧魚骨明膠提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，展開L9（34）正交試驗，設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors in orthogonal test

1.3.5 金鯧魚骨明膠性質測定

1.3.5.1 凝膠強度測定

稱取在最佳工藝條件下制得的金鯧魚骨明膠，配成濃度為6.67%的明膠溶液，在7 ℃冰箱中進行凝凍（17±1）h 之后取出，快速用TMS-Pro 質構儀測定其凝膠強度，采用直徑3 mm 圓柱形探頭，設置壓縮速度為60 mm/min，穿刺距離為4 mm，當質構儀的探頭下壓至4 mm，凝膠對探頭的反作用力（g）能夠達到最大值，這個最大反作用力也就是凝膠強度（g）[26]。

1.3.5.2 黏度測定

將6.67%的金鯧魚骨明膠溶液，置于7 ℃冰箱中凝凍（17±1）h 后取出，在 60 ℃水浴鍋中保持 1 h，旋動黏度計底座的螺釘，讓黏度計頂部的水平泡保持在中間，把處理好的金鯧魚骨明膠溶液放到NDJ-8S 型數(shù)字黏度計轉盤底下，擰開萬向接頭的保護帽，選用1 號轉子逆時針旋入黏度計萬向接頭上，設置黏度計的轉速為30 r/min，之后調整轉子高度，能夠將轉子的頁面標志剛好處于明膠溶液的頁面上之后，便啟動黏度計轉子旋轉平衡，等讀數(shù)顯示穩(wěn)定后方可讀取數(shù)值，單位為 mPa·s。

1.3.5.3 透過率的測定

配制6.67%的金鯧魚骨明膠溶液，并放在48 ℃的水浴鍋中恒溫至48 ℃，之后在45 ℃下利用分光光度計，以蒸餾水為基準校準儀器，測定450、620 nm 波長下明膠溶液的透過率（%）。

1.3.5.4 起泡性質測定

參照王珊珊等[27]的方法，測定金鯧魚骨明膠樣品（10、20、30 mg/mL）的起泡性以及起泡穩(wěn)定性。量取適量體積（V0）的金鯧魚骨明膠溶液放在50 mL 燒杯中，在轉速為13 000 r/min 時間為2 min 的高速分散器的作用下，讓金鯧魚骨明膠溶液均質起泡，隨后立即測定均質后的總體積V1，靜置了40 min 后，再記下總體積V2。明膠的起泡性根據(jù)泡沫膨脹率來表示，泡沫膨脹率和泡沫穩(wěn)定性計算公式如下：

1.3.5.5 乳化性質測定

參照王珊珊等[27]的方法，測定金鯧魚骨明膠樣品（10、20、30 mg/mL）的乳化性以及乳化穩(wěn)定性。計算公式分別為：

式中：A0為金鯧魚明膠乳化液在0 min 時的吸光度；A10為金鯧魚骨為乳化液在10 min 后的吸光度；L 為比色皿的光徑，0.01 m；N 為稀釋系數(shù)，100；C 為蛋白質的濃度，g/m2；φ 為分散相體積分數(shù)，0.25；Δt 為10 min。

1.4 紫外光譜和紅外光譜掃描分析

具體操作參照王珊珊等[28]的測定方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Oringin8.5 軟件進行數(shù)據(jù)處理后并作圖分析，其中數(shù)據(jù)則以平均值標準差的形式來表示。

2 結果與分析

2.1 金鯧魚骨基本成分分析

金鯧魚骨的基本組成成分測定結果見表2。

表2 金鯧魚骨的基本組成成分Table 2 General composition of the bone of golden pompano

表2 顯示，金鯧魚魚骨中的水分含量為（49.51±0.78）%，粗脂肪含量為（43.75±0.28）%，粗蛋白含量為（9.74±0.27）%，灰分含量為（8.80±0.19）%。由此可知金鯧魚骨的脂肪含量相對高。提取明膠的原料若有脂肪的存在，明膠會因脂肪在常溫下發(fā)生氧化酸敗而產(chǎn)生異味、影響明膠的透明度，同時脂肪也會包裹在膠原纖維的周圍而造成提膠的困難。因此在提取明膠之前需要對魚骨進行脫脂，以保證魚骨明膠的品質。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 木瓜蛋白酶添加量對明膠提取率的影響

預試驗研究發(fā)現(xiàn)，在木瓜蛋白酶添加量為4.5%時，明膠成品已經(jīng)出現(xiàn)焦黃色，正常的明膠成品顏色是淡黃色至黃色[29]，因此進一步試驗選擇酶的添加量最大不超過4.5%。不同比例木瓜蛋白酶添加量對明膠提取率的影響結果見圖1。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對明膠提取率的影響Fig.1 Effect of papain addition on gelatin extraction rate

圖1 顯示，明膠的提取率隨著木瓜蛋白酶添加量的增加而呈持續(xù)增大的趨勢。這是由于膠原蛋白分子比較緊密，木瓜蛋白酶能夠除去膠原分子間的末端肽，初步破壞膠原蛋白的三維螺旋結構，使膠原分子獲得分散的可能，逐步提高酶的濃度有助于促進酶解反應的進行，從而增大明膠的提取率[7]。同時考慮到在酶添加量為3.5%～4.5%時明膠提取率曲線上升趨勢相對平緩，從節(jié)約成本的角度考慮，提取明膠的最佳酶添加量確定為3.5%。

2.2.2 酶解溫度對明膠提取率的影響

木瓜蛋白酶不同酶解溫度對金鯧魚骨明膠提取率影響結果見圖2。

圖2 酶解溫度對明膠提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of gelatin

由圖2 可以看到，隨著溫度（45 ℃～50 ℃）的升高，明膠提取率先升高，但繼續(xù)升高溫度（50 ℃～65 ℃）明膠提取率逐漸下降，這是因為隨著溫度的升高，使酶的活力漸漸增強，在50 ℃前酶活力較小，便于控制，但在50 ℃之后先隨著溫度的升高，酶活力逐漸增大。膠原蛋白被酶解過快，酶解程度過大，不易控制，膠原蛋白生成小分子物質，使明膠提取率降低。所以提取金鯧魚骨明膠的最佳溫度為50 ℃。

2.2.3 酶解時間對明膠提取率的影響

不同酶解時間對金鯧魚骨明膠提取率的影響結果見圖3。

圖3 酶解時間對明膠提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on gelatin extraction rate

圖3 顯示，明膠提取率在0.5 h～1.5 h 這時間范圍內(nèi)是逐步增大的，但在1.5 h 之后明膠提取率逐漸減少。這是因為在1.5 h 之前，酶作用于膠原的三股螺旋結構，使膠原降解，但在1.5 h 之后酶作用時間過長，膠原蛋白分子降解過度，生成了小分子物質，使得明膠提取率下降。因此提取金鯧魚骨明膠的最佳酶解時間為1.5 h。

2.2.4 酶解pH 值對明膠提取率的影響

不同酶解pH 值對金鯧魚骨明膠提取率的影響結果見圖4。

圖4 酶解pH 值對明膠提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis pH on extraction rate of gelatin

圖4 顯示，明膠提取率隨著酶解pH 值的逐漸增大先增大后減少。pH6.0 前明膠提取率慢慢升高，pH值為6.0 時達到最高，之后逐漸下降。適宜的pH 值能夠讓酶充分發(fā)揮作用，但pH 值的升高會使酶失活或部分失活，酶也因而無法降解膠原蛋白分子而使明膠提取率下降，因而提取金鯧魚骨明膠的最佳酶解pH值為6.0。

2.3 正交試驗的結果與分析

金鯧魚骨明膠提取的正交試驗的結果見表3。

表3 正交試驗極差分析結果可知，影響金鯧魚骨明膠提取率的各因素主次關系為：A＞C＞D＞B，即酶添加量＞酶解時間＞酶解pH 值＞酶解溫度。酶添加量對金鯧魚骨明膠的影響最突出，其他因素影響相對較小。并由k 值可以得出，金鯧魚骨明膠提取的最佳工藝條件為A3B1C2D3，金鯧魚骨明膠的最佳提取條件為：酶添加量4.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時間1.5 h、酶解pH 6.5，并經(jīng)由驗證試驗得到明膠提取率為21.87%。同高倩倩[6]用硫酸從鯉魚骨提取明膠的提取率87.1%以及王珊珊等[28]用鹽酸從真鱈魚骨提取明膠的明膠提取率98.02%相比，本次試驗提取的金鯧魚骨明膠提取率是比較低的，但略大于孔麗麗等[8]胃蛋白酶酶解鰱魚骨提取明膠的提取率19.16%。傳統(tǒng)的酸堿法提取明膠產(chǎn)率相對較高，生物酶解法提取明膠，條件相對溫和，產(chǎn)率略低，但具有環(huán)境友好性。

表3 L9（34）正交試驗結果Table 3 The results of L9（34）orthogonal experiment

2.4 金鯧魚骨明膠的性質測定

2.4.1 凝膠強度、黏度、透過率分析

對金鯧魚骨明膠的凝膠強度、黏度及透過率進行測定，測定結果同國家標準GB 6783-2013《食品安全國家標準食品添加劑明膠》[29]的規(guī)定值進行對比，結果見表4。

表4 金鯧魚骨明膠的凝膠強度、黏度及透過率Table 4 Gel strength，viscosity and transmittance of golden pompano bone gelatin

由表4 中可以看出，金鯧魚骨明膠凝膠強度為（154.8±3.8）g，遠遠高于國標中規(guī)定的凝膠強度（50 g），同時也高于鰱魚骨明膠[8]的凝膠強度（144.5 g），研究[30]表明，不同來源的的明膠凝膠強度大體可分為低值（＜150）、中等（150～220）、較高（＞220），本研究所得的明膠凝膠強度在此范圍是屬于中等水平。

金鯧魚骨明膠黏度值為（2.0±0.43）mPa·s，國標中沒有明確規(guī)定明膠黏度值，稍低于孔麗麗[8]鰱魚骨明膠的黏度值4.36 mPa·s，說明金鯧魚骨明膠多肽鏈相對較短。

在 450 nm 波長下的透過率為（32±0.12）%，在620 nm 波長下的透過率（73±0.49）%，在兩個波長下的金鯧魚骨明膠的透過率均是比高于國標[29]中的透過率，說明金鯧魚骨明膠成品具有較好的透明度。

2.4.2 起泡性、乳化性質分析

金鯧魚骨明膠的起泡、乳化性質結果見表5。

如表5 所示，明膠的起泡性和起泡穩(wěn)定性是隨著明膠濃度的的增加而升高，明膠在快速攪打的條件下能夠形成起泡體，而起泡體的質構主要受到明膠含量和攪打得到的密度的影響。明膠濃度越高，明膠分子的疏水區(qū)域、黏度增大，促使明膠分子在快速攪打的過程中能夠快速的富集于氣液界面，形成緊密結合的多層膜。使明膠的起泡性和起泡穩(wěn)定性增強[31]，所以明膠可作發(fā)泡劑應用于軟糖、棉花糖中。

表5 金鯧魚骨明膠的起泡性、乳化性測定結果Table 5 Foamability and emulsifiability of gelatin from golden pompano bone

表5 中明膠的乳化性因明膠濃度的增加而逐漸增強，而乳化穩(wěn)定性卻先上升后下降了，可能是因為隨著明膠濃度增大，再增加蛋白質分子的數(shù)量，蛋白質分子在油-水液面吸附，形成的界面膜的強度和厚度不再增大反而減少。

2.4.3 紫外光譜分析

金鯧魚骨明膠和食用明膠對比，測定其紫外吸收光譜，結果見圖5。

圖5 金鯧魚骨明膠紫外光譜圖Fig.5 Ultraviolet spectrum of gelatin from golden pompano bone

如圖5 所示，金鯧魚骨明膠在228 nm 處出現(xiàn)吸收高峰，而食用明膠吸收高峰在230 nm 處，與金文剛等[30]的大鯢皮明膠最大吸收峰234 nm 及高倩倩[6]的鯉魚骨明膠最大紫外吸收峰235 nm 相接近，由此可以看出金鯧魚骨明膠的紫外光譜圖符合明膠的紫外特征吸收峰。但是金鯧魚骨明膠卻在在270 nm～280 nm 波長范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個小的吸收峰，可能是因為蛋白質中存在一些如苯丙氨酸、酪氨酸、等芳香族氨基酸殘基，會使蛋白質分子在270 nm～280 nm 范圍內(nèi)存在紫外吸收峰。

2.4.4 紅外光譜分析

紅外光譜掃描分析可以顯示明膠的二級結構的變化，一般明膠的紅外光譜可以觀察到酰胺A 帶的N-H伸縮振動，其吸收峰一般出現(xiàn)在3 400 cm-1～3 440 cm-1；酰胺 B 是由= C－H 和－NH+3的不對稱拉升引起；酰胺I 表示多肽骨架C=O 的伸縮振動，其吸收峰一般在1 636 cm-1～1 661 cm-1；酰胺 II 表示 N-H 彎曲振動和C-N 伸縮振動，其吸收峰在1 549 cm-1～1 558 cm-1；酰胺 III 代表 Gly 骨架和 Pro 側鏈的 CH2搖擺振動[28，32]，其吸收峰在1 200 cm-1～1 300 cm-1。金鯧魚骨明膠的紅外光譜圖見圖6。

圖6 金鯧魚骨明膠的紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum of gelatin from golden pompano bone

圖6 顯示，金鯧魚骨明膠的酰胺A、B 及酰胺I、II、III 的吸收峰分別出現(xiàn)在：3 334.92 cm-1、2 931.80 cm-1、1 647.20 cm-1、1 558.48 cm-1、1 338.59 cm-1處，酰胺 B、酰胺I、II 符合常見頻率范圍，酰胺A 位置稍偏低，這可能由于N-H 基團與肽鏈側基締合形成氫鍵，導致對應的酰胺A 帶吸收峰產(chǎn)生了藍移有關[16]，酰胺Ⅲ與膠原蛋白的三螺旋結構的完整性有關[33]，本試驗酰胺III吸收峰稍有偏高，說明木瓜蛋白酶酶解提取的明膠失去了三螺旋結構[34]。

3 結論

木瓜蛋白酶酶解金鯧魚骨，提取金鯧魚骨明膠的單因素試驗的最佳條件為，酶添加量為3.5%，金鯧魚骨明膠提取率為20.56%；酶解溫度為50 ℃時骨明膠提取率為20.63%；酶解時間為1.5h 時骨明膠提取率為21.35%；酶解pH 值為6.0 時骨明膠提取率為19.08%。

正交試驗確定出影響金鯧魚骨明膠提取率的主次因素依次是：酶添加量、酶解時間、酶解pH 值、酶解溫度。即金鯧魚骨中提取明膠應以酶添加量4.0%、酶解時間1.5 h、酶解溫度45 ℃、酶解pH6.5 為最佳工藝條件，金鯧魚骨明膠提取率為21.87%。

對最佳工藝條件下提取的的金鯧魚骨明膠的性質進行測定，測得金鯧魚骨明膠的凝膠強度為（154.8±3.8）g，黏度為（2.0±0.43）mPa·s，450、620 nm 波長下的透過率分別為（32±0.12）%、（73±0.49）%，起泡性、起泡穩(wěn)定性以及乳化性均隨著明膠濃度的增加而增強，而乳化穩(wěn)定性卻隨著明膠濃度的增加先增強后減弱。紫外光譜和紅外光譜掃描均具有明膠的特征吸收峰。