響應(yīng)面優(yōu)化開(kāi)菲爾粒發(fā)酵復(fù)合果蔬汁工藝及體外消化特性分析

陳樹(shù)俊，鄭婕

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

開(kāi)菲爾粒，起源于俄羅斯北高加索地區(qū)，是由多種乳酸菌屬與酵母菌等微生物之間共生而形成的特殊粒狀結(jié)構(gòu)[1]，已有研究證明，開(kāi)菲爾粒中乳酸菌數(shù)量占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（包括乳球菌屬和乳桿菌屬），占細(xì)菌總數(shù)的80%左右，其次是酵母菌[2]。其含有的活菌對(duì)沙門(mén)氏菌、結(jié)核分枝桿菌、大腸桿菌等致病菌均有強(qiáng)烈抑制作用，經(jīng)常食用開(kāi)菲爾制品可維持人體胃腸道中優(yōu)勢(shì)有益菌群，同時(shí)還具有輔助降低血清膽固醇，延緩衰老，提高機(jī)體抵抗力作用[3]。

當(dāng)前市場(chǎng)上，大多數(shù)發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品選用的發(fā)酵菌種單一、果蔬原料單調(diào)[4]，這一定程度上限制了果蔬發(fā)酵制品的種類(lèi)和產(chǎn)品風(fēng)味[5]；針對(duì)開(kāi)菲爾粒研究多限于乳制品，在果蔬汁領(lǐng)域的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道，且目前研究中缺乏發(fā)酵果蔬汁在胃腸消化環(huán)境中對(duì)于抗氧化能力和功能活性物質(zhì)變化規(guī)律的探討。因此本試驗(yàn)擬選用開(kāi)菲爾粒作為發(fā)酵劑，采用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合果蔬汁發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行研究，并在體外模擬胃腸消化基礎(chǔ)上分析果蔬汁發(fā)酵前后酚類(lèi)物質(zhì)含量和抗氧化活性變化規(guī)律，更加貼近人體實(shí)際對(duì)其消化吸收情況，可為開(kāi)菲爾粒發(fā)酵制品在體內(nèi)的功能研究提供參考，為開(kāi)發(fā)相關(guān)果蔬發(fā)酵產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹濃縮汁、葡萄濃縮汁、沙棘原漿、胡蘿卜濃縮汁：天津悅梵泰有限公司；開(kāi)菲爾粒（乳酸菌∶酵母菌數(shù)量比約為9 ∶1）：山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；乳酸菌固體培養(yǎng)基、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、?；悄懰徕c：北京索萊寶科技有限公司；硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、水楊酸、過(guò)氧化氫、氯化鐵、三氯乙酸、鄰苯三酚、鹽酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SC-3610 低速離心機(jī)：安徽中科中佳儀器有限公司；HRHS24 電熱恒溫水浴鍋：青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；YXQ-LS-75SII 全自動(dòng)高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HPS-250 生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；FE20 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生產(chǎn)工藝流程

果汁按比例調(diào)配→復(fù)合果蔬汁→調(diào)節(jié)pH 值至4.5 左右→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→成品→檢驗(yàn)

1.3.2 發(fā)酵要點(diǎn)

1）果汁復(fù)配：分別將葡萄、桑椹濃縮汁采用純凈水按料液比1 ∶3（體積比）稀釋至 17°Brix，胡蘿卜濃縮汁按料液比 1 ∶2（體積比）稀釋至 11°Brix，備用。按比例為桑椹添加量15%，葡萄汁添加量30%、胡蘿卜汁添加量30%，沙棘汁添加量11%進(jìn)行復(fù)配制得復(fù)合果蔬汁。

2）滅菌、冷卻：將復(fù)配好的果汁，115 ℃滅菌 15 min，待冷卻。

3）菌種活化稀釋：將開(kāi)菲爾粒接種于純牛奶中，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h 進(jìn)行活化，活化后取1 粒開(kāi)菲爾粒（約1 cm3）經(jīng)無(wú)菌研磨后置入滅菌生理鹽水，溶液加玻璃珠混勻，制成初次稀釋液，取0.5 mL 初次稀釋液注入4.5 mL 滅菌生理鹽水，用吸管反復(fù)吹打使菌體分布均勻，重復(fù)稀釋步驟稀釋至活菌總數(shù)濃度約為106CFU/mL，作為菌種接種液備用[6]。

4）接種：復(fù)合果蔬汁經(jīng)滅菌后，接入菌種接種液，接種量為5%。

5）保溫發(fā)酵：在28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，一定時(shí)間后測(cè)其酸度、活菌數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以活菌數(shù)和酸度為指標(biāo)，考察發(fā)酵溫度（25、28、31、34、37 ℃）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）和發(fā)酵時(shí)間（32、36、40、44、48 h）3 個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效果的影響。采用控制變量法，其中發(fā)酵的初始條件為發(fā)酵溫度28 ℃、接種量5%、發(fā)酵時(shí)間36 h。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，考察因素之間的交互作用并得到最佳發(fā)酵工藝條件。以活菌數(shù)和酸度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for response surface analysis

1.3.5 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前后胃腸消化功能特性

模擬體外消化過(guò)程參考Hou FL 等[7-8]的方法并稍作改動(dòng)。

1）模擬胃消化：移取1 mL 復(fù)合果蔬汁融于4 mL無(wú)菌水置于離心管中，加入0.5 mL 1 mol/L HCl 溶液（此時(shí)混合液pH 值為2），隨后加入160 mg 胃蛋白酶（3 000 U/mg），將混合液放置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃避光振蕩培養(yǎng)（厭氧條件）。

2）模擬腸消化：以經(jīng)過(guò)胃消化2 h 的樣品作為腸消化的初始時(shí)間0 h，向混合液中逐滴加入1 mol/L NaHCO3至pH 7.5，隨后加入18 mL 混合物（2 mg/mL的胰蛋白酶液與12 mg/mL 的膽酸鹽體積比為12 ∶6），37 ℃避光振蕩培養(yǎng)（厭氧條件）。消化每隔30 min 取樣，并將樣品快速酸化至pH 值為2，測(cè)定消化過(guò)程中果蔬汁多酚含量、黃酮含量、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率的變化情況。

1.3.6 指標(biāo)測(cè)定

1.3.6.1 酸度的測(cè)定

參照GB 5009.239-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》。

1.3.6.2 活菌數(shù)的測(cè)定

開(kāi)菲爾粒中主要菌相為乳酸菌和酵母菌，因此本試驗(yàn)活菌數(shù)指標(biāo)數(shù)為乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)總和。

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵至一定時(shí)間后，取0.5 mL 發(fā)酵液用4.5 mL 滅菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上。

1）乳酸菌：采用乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（lactic acid bacteria culture medium，MRS) 固體培養(yǎng)基，37 ℃需氧培養(yǎng)48 h，計(jì)算其活菌數(shù)。

2）酵母菌：采用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose agar，YPD） 培養(yǎng)基，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，計(jì)算其活菌數(shù)。

1.3.6.3 總多酚、總黃酮含量的測(cè)定

參照 Berker 等[9]的方法，采用 Folin-Ciocalteu 法測(cè)定總酚含量；采用NaNO2-Al（NO3）3分光光度法測(cè)定樣品中黃酮的含量[10]。

1.3.6.4 體外消化抗氧化性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11-12]的方法對(duì)復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前后樣品液進(jìn)行DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率的測(cè)定與分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均以平均值表示。試驗(yàn)圖表采用Origin 7.5 繪制，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-Expert 8.0 軟件，方差分析用Minitab 15 數(shù)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)、酸度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)、酸度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the number of viable bacteria and acidity

發(fā)酵時(shí)間直接決定了果蔬汁的發(fā)酵程度和產(chǎn)酸量，由圖1 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)、酸度趨勢(shì)均先上升后趨于平緩。原因可能是開(kāi)菲爾菌是一個(gè)復(fù)雜微生物互生體系，含有大量的乳酸菌，將其加入到果蔬汁后，菌體大量生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酸，使果蔬汁環(huán)境酸化，適宜的酸度可以有效提高活菌數(shù)，繼而使酸度呈上升趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵到40 h 時(shí)，過(guò)多乳酸的積累和營(yíng)養(yǎng)的消耗會(huì)限制開(kāi)菲爾菌的增殖，導(dǎo)致活菌數(shù)變化不顯著（P＞0.05），說(shuō)明在此發(fā)酵基質(zhì)中產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因此選擇發(fā)酵時(shí)間為40 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)、酸度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)、酸度的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the number of viable bacteria and acidity

溫度是影響微生物發(fā)酵的重要外界因素，可以顯著影響菌體數(shù)量，進(jìn)而影響產(chǎn)酸量。從圖2 中可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃～31 ℃時(shí)，菌種數(shù)量和產(chǎn)酸速度較快，當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)31 ℃時(shí)，活菌數(shù)變化不顯著，酸度變化略有增加，但已基本穩(wěn)定。原因可能是溫度的增加會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)中優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)生變化，各菌種之間相互制約，抑制了乳酸菌的增殖，導(dǎo)致活菌數(shù)趨于穩(wěn)定狀態(tài)，酸度上升不顯著（P＞0.05），這也與Rose等[13]的研究結(jié)果相類(lèi)似。

2.1.3 接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

接種量對(duì)活菌數(shù)、酸度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 接種量對(duì)活菌數(shù)、酸度的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the number of viable bacteria and acidity

由圖3 可知，隨著接種量的增加，酸度、活菌數(shù)先上升后趨于平緩。接種量的大小會(huì)直接影響開(kāi)菲爾菌在果蔬汁中的定殖，當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)，用于發(fā)酵的活菌數(shù)量少，導(dǎo)致果蔬汁發(fā)酵不充分，增加發(fā)酵成本。當(dāng)接種量超過(guò)7%時(shí)，酸度變化已無(wú)顯著差異（P＞0.05），繼續(xù)加大接種量會(huì)使發(fā)酵前期果蔬汁酸度過(guò)快降低，對(duì)果汁品質(zhì)造成不利影響，綜合接種量對(duì)各指標(biāo)的影響，選擇接種量為7%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 開(kāi)菲爾發(fā)酵復(fù)合果蔬汁響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為了確定開(kāi)菲爾粒發(fā)酵復(fù)合果汁最佳發(fā)酵條件，選擇發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度與接種量3 個(gè)因素，以活菌數(shù)和酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental designs and results for response surface analysis

2.2.2 回歸方程及參數(shù)分析

利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，分別得到各個(gè)因素對(duì)樣品酸度和活菌數(shù)兩個(gè)指標(biāo)的二次回歸方程分別如下：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由方差分析可知，失擬項(xiàng)P 值分別為0.062 0，0.465 9（P＞0.05），表明失擬項(xiàng)相對(duì)于純誤差來(lái)說(shuō)不顯著，模型擬合性較好。其次，模型軟件分析的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為96.08%（97.8%），表示模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型成立，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)根據(jù)表中F 值大小，可以判斷3 個(gè)因素對(duì)兩個(gè)響應(yīng)值影響的主次順序，其中，影響樣品酸度、活菌數(shù)因素主次均為A＞B＞C，即發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞接種量；再觀察各響應(yīng)值P 值變化，從P 值可以了解到，A、B、AB、A2、B2、C2對(duì)樣品酸度有極顯著影響（P＜0.01），A、B、C、AC、A2、B2、C2對(duì)樣品活菌數(shù)有極顯著影響（P＜0.01）。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化及分析

2.2.3.1 3 個(gè)因素交互作用對(duì)樣品酸度的影響

3 個(gè)因素交互作用對(duì)果蔬汁發(fā)酵酸度的影響見(jiàn)圖4。

如圖4a 所示，在以接種量為中心水平時(shí)，酸度隨發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度的增加呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，圖中等高線呈橢圓形，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度交互作用顯著。較高的發(fā)酵溫度會(huì)加速乳酸菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多的乳酸使pH 值迅速降低，但過(guò)低的pH值反而會(huì)抑制乳酸菌的活性，繼而使發(fā)酵液酸度無(wú)顯著變化。由圖4b 可知，在以發(fā)酵溫度為中心水平時(shí)，酸度隨著接種量與發(fā)酵時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先上升后無(wú)顯著差異的變化（P>0.05），等高線表明AC 二者交互作用顯著。由圖4c 可知，發(fā)酵溫度響應(yīng)面曲面陡于接種量曲面，說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)酸度影響更大，原因可能是適宜的溫度提高了開(kāi)菲爾菌的活性，使酵母菌、乳酸菌等菌種更加活躍，加速產(chǎn)酸導(dǎo)致響應(yīng)面曲面變化更快，這也與方差分析結(jié)果一致。

圖4 3 因素交互作用對(duì)果蔬汁發(fā)酵酸度的影響Fig.4 Influence of interaction of three factors on acidity of fruit and vegetable juice fermentation

2.2.3.2 3 個(gè)因素交互作用對(duì)樣品活菌數(shù)的影響

3 個(gè)因素交互作用對(duì)果蔬汁活菌數(shù)的影響見(jiàn)圖5。

圖5a 表明，果蔬汁活菌數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，隨著發(fā)酵溫度的上升先增加后略有下降。

圖5 3 因素交互作用對(duì)果蔬汁活菌數(shù)的影響Fig.5 Influence of interaction of three factors on the number of viable bacteria in fruit and vegetable juice

在接種量一定時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液活菌數(shù)最終趨于穩(wěn)定趨勢(shì)，原因可能是經(jīng)過(guò)一段發(fā)酵時(shí)間后，發(fā)酵菌已進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，且發(fā)酵基質(zhì)的理化條件也發(fā)生了改變，不適宜新菌的生長(zhǎng)和增殖。發(fā)酵時(shí)間響應(yīng)面曲面坡度陡于發(fā)酵溫度曲面，說(shuō)明活菌數(shù)受發(fā)酵時(shí)間影響較大，在以發(fā)酵溫度為中心水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間和接種量交互作用顯著。從圖5c 中可以看出，活菌數(shù)隨著接種量和發(fā)酵溫度的增加先上升后緩慢下降，原因可能是接種量的增加雖可以有效的提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)，但過(guò)多的活菌會(huì)加速碳、氮源物質(zhì)消耗，使發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)多，不利于益生菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致活菌數(shù)無(wú)明顯變化甚至略有下降，繼而影響發(fā)酵液酸度，與酸度響應(yīng)面分析結(jié)果一致。

2.2.4 最佳開(kāi)菲爾發(fā)酵果蔬汁工藝條件的確定

通過(guò)Design-Expert 8.0 軟件分析，得到發(fā)酵最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度32.06 ℃、接種量7.25%、發(fā)酵時(shí)間41.65 h，在該工藝條件下，果蔬汁的開(kāi)菲爾發(fā)酵酸度理論值可達(dá)0.803%，活菌數(shù)可達(dá)7.1×108（CFU/mL）?？紤]到試驗(yàn)實(shí)際操作，將最優(yōu)工藝條件調(diào)整為：發(fā)酵溫度32 ℃、接種量7.3%、發(fā)酵時(shí)間41.7 h。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果可靠性，采用調(diào)整得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，經(jīng)過(guò)3 次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得果蔬汁發(fā)酵酸度為0.837%，活菌數(shù)為8.3×108（CFU/mL），其相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明回歸模型的擬合度較高，可以利用響應(yīng)面法對(duì)果蔬汁開(kāi)菲爾粒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 模擬消化過(guò)程中抗氧化能力結(jié)果分析

2.3.1 胃腸消化對(duì)果蔬汁多酚含量的影響

體外消化過(guò)程中總酚含量的變化見(jiàn)圖6。

圖6 體外消化過(guò)程中總酚含量的變化Fig.6 Changes in total polyphenol content during in vitro digestion of celery juice and extract

從圖6 中可以看出，在胃腸消化過(guò)程中，發(fā)酵果蔬汁的多酚含量和釋放速率顯著高于未發(fā)酵組（P＜0.01），且在胃腸消化結(jié)束時(shí)，發(fā)酵組多酚含量是未發(fā)酵組的 1.95 倍、未消化時(shí)的 1.72 倍（P＜0.01）。說(shuō)明開(kāi)菲爾粒發(fā)酵可以顯著增加果蔬汁多酚含量，在人體消化系統(tǒng)中具有良好的益生潛力。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵后形成的酸性環(huán)境能減少多酚的破壞降解，發(fā)酵菌所產(chǎn)生的酶系能切斷結(jié)合態(tài)多酚纖維素、半纖維素之間的共價(jià)鍵，如植物細(xì)胞壁多糖共價(jià)鍵和木質(zhì)素酯鍵等，從而釋放出更多的可溶性多酚，造成總酚含量的增加；在模擬消化過(guò)程中，胃酸和胃蛋白酶會(huì)減弱部分酚酸與細(xì)胞壁之間的酯鍵，使酚酸得以釋放，同時(shí)胰蛋白酶和膽汁可以作用于多酚與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵，使其脫離出更多的自由酚，從而使發(fā)酵果蔬汁多酚含量在經(jīng)過(guò)胃消化后顯著升高，在腸消化過(guò)程中進(jìn)一步升高，這也與BOUAYED 等[14-15]對(duì)蘋(píng)果進(jìn)行體外模擬消化研究所得結(jié)果相似。

2.3.2 胃腸消化對(duì)果蔬汁黃酮含量的影響

體外消化過(guò)程中總黃酮含量的變化見(jiàn)圖7。

圖7 體外消化過(guò)程中總黃酮含量的變化Fig.7 Changes in total flavonoid content during in vitro digestion of celery juice and extract

從圖7 中可以看出，復(fù)合果蔬汁黃酮含量在胃消化過(guò)程中顯著升高（P＜0.05），此消化階段結(jié)束時(shí)，發(fā)酵組果蔬汁黃酮含量較未消化（胃0 h）和未發(fā)酵組（胃2.5 h）分別提高了50%、57.37%，具有顯著性差異（P＜0.05）。推測(cè)出開(kāi)菲爾粒發(fā)酵可有效的促進(jìn)黃酮類(lèi)物質(zhì)的釋放，可能是由于其含有的乳酸菌和酵母菌代謝產(chǎn)生的豐富酶系會(huì)轉(zhuǎn)化部分碳源物質(zhì)，生成能發(fā)生顯色反應(yīng)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)[16]，從而使發(fā)酵后的果蔬汁黃酮含量顯著增加，Sun 等[17]研究也已證明發(fā)酵過(guò)程中微生物會(huì)引起植物細(xì)胞的破裂，引起不同抗氧化物質(zhì)的釋放與合成。同時(shí)胃液較低的pH 環(huán)境可以有效避免黃酮類(lèi)化合物的降解，胃蛋白酶、胃酸均能促進(jìn)結(jié)合態(tài)黃酮類(lèi)化合物的釋放，導(dǎo)致隨著胃消化時(shí)間的延長(zhǎng)黃酮含量升高；在腸消化階段含量有所下降，可能是因?yàn)閺乃嵝缘奈敢涵h(huán)境中過(guò)渡到中性或弱堿性的腸液環(huán)境，黃酮容易降解為酚醛或其它化合物，從而降低了復(fù)合果蔬汁中的黃酮含量。

2.3.3 模擬胃液處理對(duì)果蔬汁自由基清除率的影響

胃消化對(duì)果蔬汁自由基清除率影響見(jiàn)圖8。胃消化過(guò)程中活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析見(jiàn)表4。

圖8 胃消化對(duì)果蔬汁自由基清除率影響Fig.8 Effect of gastric digestion on free radical scavenging rate of fruit and vegetable juice

表4 胃消化過(guò)程中活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of active ingredients and antioxidant capacity in the process of digestion in the stomach

胃液消化過(guò)程中果蔬汁抗氧化活性的變化如圖8所示，清除率隨消化時(shí)間呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）。在DPPH 自由基清除率體系中，發(fā)酵組、未發(fā)酵組清除率分別為84.6%、69.3%，較未消化時(shí)分別提高了13.3%、8.9%，存在顯著性差異（P＜0.05）；在 ABTS+自由基清除率體系中，發(fā)酵組清除率較未發(fā)酵組提高了9.5%，較消化前提高了8.5%（P＜0.05），結(jié)合胃消化0 h，清除率強(qiáng)弱順序?yàn)榘l(fā)酵消化組＞發(fā)酵未消化組＞消化未發(fā)酵組＞未發(fā)酵組，說(shuō)明開(kāi)菲爾粒發(fā)酵和胃消化過(guò)程均可以提高復(fù)合果蔬汁的自由基清除能力，Tagliazucchi等[18]均有研究表示，樣品經(jīng)模擬胃液消化后多酚釋放量和抗氧化活性有所提高。原因可能是由于微生物發(fā)酵使果蔬汁抗氧化物質(zhì)含量顯著增加，加上胃部酸性環(huán)境有利于酚類(lèi)物質(zhì)繼續(xù)水解苷類(lèi)化合物變成相應(yīng)苷元，使多酚、黃酮含量有所上升[19-20]，從而對(duì)自由基的清除率也顯著提高，這一結(jié)果也可由表4 看出，多酚、黃酮含量與DPPH 自由基清除率有顯著正相關(guān)性（r=0.950，0.947）。由表4 可知，活性成分含量與ABTS+自由基清除能力的相關(guān)度較低（r=0.755，0.682），因此推斷發(fā)酵果蔬汁對(duì)ABTS+自由基的抗氧化能力是由多酚黃酮同多種生物活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果，其它發(fā)揮作用的活性物質(zhì)可能是發(fā)酵菌株細(xì)胞產(chǎn)生的多糖和蛋白，例如酵母細(xì)胞壁內(nèi)的葡聚糖，具有很強(qiáng)的抗氧化作用；同時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還含有很多內(nèi)生的抗氧化劑，都可以促進(jìn)ABTS+自由基清除率的顯著提高。

2.3.4 模擬腸液處理對(duì)果蔬汁自由基清除率的影響

腸消化對(duì)果蔬汁自由基清除率影響見(jiàn)圖9。腸消化過(guò)程中活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析見(jiàn)表5。

圖9 腸消化對(duì)果蔬汁自由基清除率影響Fig.9 Effect of intestinal digestion on free radical scavenging rate of fruit and vegetable juice

表5 腸消化過(guò)程中活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of active ingredients and antioxidant capacity in intestinal digestion process

將果蔬汁經(jīng)過(guò)胃液處理后再經(jīng)腸液處理，分析其對(duì)自由基清除率的影響。由圖9 可知，隨著腸消化時(shí)間的延長(zhǎng)，自由基清除率先上升后趨于平緩，腸消化結(jié)束時(shí)，發(fā)酵組DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率分別比未發(fā)酵組高12.8%、14.7%，比消化前高10.1%、12%，具有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明果蔬汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵和腸消化后會(huì)具有更強(qiáng)的抗氧化活性。由表5 可知，發(fā)酵組DPPH 自由基清除率與多酚含量呈顯著正相關(guān)性（r=0.897），顯示模擬腸消化中的多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵果蔬汁的抗氧化能力起主導(dǎo)作用。ABTS+自由基清除率與多酚、黃酮含量的相關(guān)性較差，說(shuō)明ABTS+自由基清除率是發(fā)酵果蔬汁體系中所有抗氧化物質(zhì)共同作用的結(jié)果，可能是除酚類(lèi)酮類(lèi)物質(zhì)外，發(fā)酵菌種開(kāi)菲爾粒富含乳酸菌，已有研究證明乳酸菌被食用后會(huì)停留在腸道一定時(shí)間，通過(guò)代謝反應(yīng)向細(xì)胞壁外分泌一些代謝產(chǎn)物如胞外多糖和生物活性肽[21-22]，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)揮抗氧化作用，抑制自由基連鎖反應(yīng)的發(fā)生；在腸消化過(guò)程中，胰酶和膽汁的協(xié)同效應(yīng)也可水解某些物質(zhì)生成抗氧化劑[23-24]，提高發(fā)酵液的自由基清除率。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酸度和活菌數(shù)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了開(kāi)菲爾粒發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的最佳工藝。經(jīng)回歸分析及實(shí)際操作可行性，確定最佳發(fā)酵參數(shù)為發(fā)酵溫度32 ℃、接種量7.3%、發(fā)酵時(shí)間41.7 h；此條件下，果蔬汁發(fā)酵酸度為0.837%，活菌數(shù)為8.3×108CFU/mL。通過(guò)模擬體外消化，對(duì)復(fù)合果蔬汁發(fā)酵前后的多酚含量、黃酮含量、抗氧化性進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：與未發(fā)酵樣品相比，發(fā)酵果蔬汁的黃酮、多酚含量經(jīng)過(guò)消化后明顯升高，在模擬胃液消化中升高最顯著；發(fā)酵后，對(duì)DPPH、ABTS+自由基清除能力顯著高于未發(fā)酵組，且在胃腸消化中抗氧化活性得到進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明利用開(kāi)菲爾粒發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能活性，可以適應(yīng)人體消化環(huán)境，發(fā)揮其益生功能，為今后開(kāi)菲爾粒在果蔬產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)和參考價(jià)值。