響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化牛骨湯酶解工藝及其鈣含量分析

李玉昕，朱迎春，衛(wèi)云云，吉玉程

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030801）

膠原蛋白是骨湯中的重要成分[1]，通過(guò)酶解可以將其水解為膠原多肽和氨基酸，能夠有效提高膠原蛋白的吸收利用率[2-3]。此外，酶解液可顯著提高膠原蛋白的溶解性、保水性、熱反應(yīng)力，降低水解液黏度[4]。

用作酶解骨膠原蛋白的酶主要有三類：植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶等）、動(dòng)物蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶等）和微生物蛋白酶[5-8]。肖龍泉等[9]以水解度為指標(biāo)，考察木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對(duì)膠原蛋白的酶解效果。文旭娟等分析[10]了酶種類、濃度和時(shí)間對(duì)水解度（degree of hydrolysis，DH）、肽鏈長(zhǎng)度及游離鈣含量的影響，并從中篩選出了最優(yōu)方案。劉小蕾[11]以水解度和三氯乙酸-氮溶解指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別在胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶4 種蛋白酶的最適條件下對(duì)豬骨湯進(jìn)行酶解，篩選酶解骨湯的最佳單一酶和復(fù)配酶，并對(duì)其工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

牛骨中膠原蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸比例均衡，此外還含有鈣、鈉、鎂、鉀、鐵等礦物元素和豐富的維生素[12]。在牛肉加工產(chǎn)業(yè)中，牛骨作為副產(chǎn)物往往被廢棄或加工成附加值較低的飼料用牛骨粉[13]。為充分利用牛骨資源，本試驗(yàn)通過(guò)常壓蒸煮制得牛骨湯。為了提高膠原蛋白和鈣的利用率，試驗(yàn)從3 種酶制劑中篩選最佳用酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化其酶解工藝，并對(duì)骨湯中可溶出性鈣含量進(jìn)行了分析，以期為牛骨湯的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復(fù)合蛋白酶（1.2×105U/g）：上海金穗生物科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（3×104U/g）、木瓜蛋白酶（8×105U/g）：四川樂(lè)山井研食品公司。

酚酞、乙醇、甲醛、NaOH 等試劑均為分析純：天津化學(xué)試劑一廠。

酸度計(jì)（PB-10）：瑞典Sartorius 公司；電子恒溫水浴鍋（ZKW-4）：常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；電子天平（LT 100 型）：北京中興偉業(yè)公司；離心機(jī)（ST40R）：德國(guó)Theromo Scientific 公司；強(qiáng)力碎骨機(jī)（SGJ-360型）：廊坊市惠友機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛骨湯熬制

將冷凍牛骨清水解凍，反復(fù)沖洗干凈，放入鍋中進(jìn)行預(yù)煮，去除淤血和雜質(zhì)等。溫水沖洗牛骨，利用碎骨機(jī)將其破碎成3 mm×3 mm 大小的塊狀。將處理好的小塊牛骨放入鍋中，以牛骨∶水=1 ∶3 質(zhì)量比例熬制，大火熬制6 h[14]后換小火慢熬6 h，熬制過(guò)程中補(bǔ)足揮發(fā)的水分。雙層紗布過(guò)濾熬制好的牛骨湯，過(guò)濾兩次后4 ℃冷藏備用。

1.2.2 水解度測(cè)定

采用甲醛滴定法[15]。甲醛可與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基衍生物，使氨基上的H+游離出來(lái)，可以用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定釋放出的H+，測(cè)定氨基氮含量，計(jì)算游離氨基含量。計(jì)算公式如下：

式中：V 為樣品消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0為 空 白 消 耗 NaOH 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 的 體 積 ，mL；N 為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；14.008 為 1 mL 濃度為1.000 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，mg。

1.2.3 鈣含量測(cè)定

將過(guò)濾后的牛骨清湯經(jīng)硝酸和高氯酸濕法消化處理后，采用乙二胺四乙酸滴定法測(cè)定鈣含量[16]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 最適酶制劑選擇

選擇風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶3 種酶對(duì)牛骨湯進(jìn)行酶解，酶解條件如表1 所示。以牛骨湯中蛋白質(zhì)的水解度為指標(biāo)，篩選出最佳酶制劑。

表1 3 種蛋白酶酶解條件Table 1 Optimal conditions for enzymatic hydrolysis of three proteases

1.3.2 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)在確定最佳用酶的基礎(chǔ)上，以骨湯質(zhì)量為基準(zhǔn)，考察酶解 pH 值（7.0、7.3、7.6、7.9 和 8.2）、酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）、酶解時(shí)間（2.0、2.5、3.0、3.5、4 h）、加酶量（0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%）對(duì)水解度的影響，并確定單酶水解條件的最適范圍。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件，以蛋白質(zhì)水解度為指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。因素水平表如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 The level table of test factor in response surface

1.3.4 最佳酶解工藝條件下鈣含量的測(cè)定

取熬制后的牛骨湯測(cè)定游離鈣含量，最佳酶解條件酶解后測(cè)定其游離鈣含量，測(cè)定最佳酶解工藝條件下游離鈣的增加量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1 軟件包（St Paul，MN）進(jìn)行差異顯著性分析，采用Design-Expert8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用SigmaPlot 10.0 繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

表3 所示為3 種酶在其較適條件下的水解度。

表3 3 種酶最適條件下的水解度Table 3 Hydrolysis degree of the three enzymes under optimum conditions

由表3 可知，在同樣的酶解時(shí)間和加酶量下，復(fù)合蛋白酶水解度最大，顯著高于其他兩種酶（p＜0.05）。復(fù)合蛋白酶是由篩選的米曲霉菌株經(jīng)深層發(fā)酵生產(chǎn)的肽酶復(fù)合物，含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶兩種酶活力，其水解蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng)[17]，故選用復(fù)合蛋白酶作為后續(xù)研究的最適用酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 加酶量對(duì)水解度的影響

加酶量對(duì)牛骨湯水解度的影響如圖1 所示。

圖1 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effects of different enzyme dosage on hydrolysis degree

由圖1 可知，加酶量在0.4%～1.0%時(shí)，牛骨湯的水解度顯著升高（p＜0.05），加酶量在1.0%～1.2%時(shí)，水解度升高速率變緩。這是因?yàn)殡S著加酶量的增加，酶與底物的接觸面積增大，水解度顯著升高（p＜0.05）。但酶與底物接觸的面積是有限的，當(dāng)酶與底物基本結(jié)合完全時(shí)，再增加用酶量，對(duì)水解度的影響不大[18-19]（p＞0.05）。考慮到經(jīng)濟(jì)成本，確定最適加酶量為1.0%。

2.2.2 酶解溫度對(duì)水解度的影響

酶解溫度對(duì)牛骨湯水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.2 Influence of different enzymatic hydrolysis temperatures on hydrolysis degree

由圖2 可知，酶解溫度為45 ℃～55 ℃時(shí)，牛骨湯水解度逐漸升高，且在55 ℃達(dá)到最高值為2.87%，酶解溫度為55 ℃～65 ℃時(shí)，水解度有所下降。酶解反應(yīng)時(shí)，酶解溫度非常重要，溫度上升加大了酶與底物蛋白之間發(fā)生碰撞的幾率，促進(jìn)了酶促反應(yīng)，但升溫超過(guò)酶所能承受的最大溫度時(shí)酶分子結(jié)構(gòu)遭到破壞而喪失或部分喪失活性，酶促反應(yīng)速率下降[20]。因此，確定最適酶解溫度為55 ℃。

2.2.3 pH 值對(duì)水解度的影響

圖3 為不同pH 值對(duì)牛骨湯水解度的影響。

圖3 不同pH 值對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of different pH on hydrolysis degree

由圖3 可知，pH 值為7.0～7.6 時(shí)，牛骨湯水解度顯著升高（P＜0.05），且在 pH 值為 7.6 時(shí)水解度達(dá)到最高值4.13%，pH 值為7.6～8.2 時(shí)，水解度下降。酶解反應(yīng)時(shí)，酶只在一定pH 值范圍內(nèi)發(fā)揮作用，pH 值過(guò)高或過(guò)低時(shí)都會(huì)使酶的活性降低[21]。因此，確定最適酶解pH 值為 7.6。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

不同酶解時(shí)間對(duì)牛骨湯水解度的影響見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，酶解時(shí)間由2 h 增加到3.5 h 時(shí)，水解度逐漸升高并達(dá)到最高值4.48%。當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，水解度則變化不顯著（P＞0.05）。酶解過(guò)程中，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物也逐漸增加，但當(dāng)酶解產(chǎn)物增加到一定量時(shí)會(huì)反過(guò)來(lái)抑制復(fù)合蛋白酶的活性[22]，從而使牛骨湯的水解度保持相對(duì)平穩(wěn)但略有降低。

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Influence of different time on hydrolysis degree

綜上所述，單因素試驗(yàn)中，復(fù)合蛋白酶的適宜酶解條件為加酶量1.0%、溫度55 ℃、pH 值7.6、酶解時(shí)間3.5 h。在此條件下，牛骨湯水解度為4.48%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇初始pH 值、酶解溫度（℃）、酶解時(shí)間（h）和加酶量（%）為自變量，水解度DH為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)出Box-Behnken 中心組合進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Response surface test design and results

續(xù)表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 4 Response surface test design and results

2.3.2 回歸方程的建立與方差分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合后，得到回歸方程：水解度（Y）=4.90+0.12A-0.11B+0.042C+0.30D-0.005AB+0.047AC+0.10AD+0.095BC-0.045BD-0.050CD-0.56A2-0.80B2-1.02C2-0.18D2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis

由表5 可知：模型P＜0.000 1，模型極顯著。失擬項(xiàng)F 值為 4.30，P 值為 0.086 4（P＞0.05），不顯著，說(shuō)明模型的擬合度很好。回歸模型的R2Adj=0.976 3，證明該回歸模型能很好的預(yù)測(cè)牛骨湯酶解工藝的結(jié)果。

該模型顯著性檢驗(yàn)顯示，除了 C（pH 值）（P＞0.05）不顯著外，一次項(xiàng) A（酶解時(shí)間）、B（酶解溫度）、D（加酶量）對(duì)水解度影響顯著（P＜0.05），比較 A、B、C、D 4個(gè)因素的F 值大小可知，4 個(gè)因素對(duì)水解度的影響依次為：加酶量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞初始pH 值。

模型中二次項(xiàng) A2、B2、C2極顯著（P＜0.000 1），D2為顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)（AB、AC、AD、BC、CD）對(duì)水解度影響均不顯著（P＞0.05）。

2.3.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

將酶解時(shí)間、酶解溫度、初始pH 值、加酶量的取值范圍分別設(shè)定為酶解時(shí)間3.0 h～4.0 h、酶解溫度50 ℃～60 ℃、初始 pH 值 7.3～7.9、加酶量 0.8%～1.2%，并將目標(biāo)值設(shè)定為最大值，通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件獲得最優(yōu)組合為酶解時(shí)間3.53 h、酶解溫度53.01 ℃、初始pH 值7.60、加酶量1.16%。在此最優(yōu)組合中，理論最佳牛骨湯水解度為4.86%，根據(jù)實(shí)際條件的限制將最優(yōu)組合修正為酶解時(shí)間3.5 h、酶解溫度53 ℃、初始pH 值7.60、加酶量1.16%。此時(shí)得到4.83%，與預(yù)測(cè)值很接近。

2.4 酶解液游離鈣含量的測(cè)定結(jié)果

取熬制好的牛骨湯過(guò)濾后測(cè)定游離鈣含量為8.00 mg/100 mL，最優(yōu)條件酶解之后再次測(cè)定游離鈣含量為14.00 mg/100 mL。由此可見(jiàn)，通過(guò)酶解游離鈣含量增加了75%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)比3 種蛋白酶對(duì)牛骨湯的酶解效果，篩選出酶解牛骨湯的最佳蛋白酶為復(fù)合蛋白酶。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)因素的水平，并通過(guò)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)優(yōu)化其酶解工藝，得到牛骨湯最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：酶解時(shí)間為3.5 h，酶解溫度為53 ℃，酶解pH 值為7.60，加酶量為1.16%。在此條件下，所得牛骨湯酶解液水解度為4.83%，游離鈣含量從8.00 mg/100 mL 增加到14.00 mg/100 mL，增加了75%。