陳皮與普洱茶總黃酮的協(xié)同抗氧化作用研究

呂平，潘思軼

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070）

柑普茶是五邑特產(chǎn)之一，它選用廣東省江門市新會柑和云南西雙版納勐?？h普洱茶為原料，經(jīng)特殊工藝加工而成，無任何添加劑[1]。大紅柑柑普茶選用的大紅柑原料與新會陳皮原料相同且加工工藝近似。近年來，有關(guān)陳皮和普洱茶的功效和成分研究較多，有關(guān)陳皮與普洱茶混合（柑普茶）后的功效變化鮮有研究。普洱茶具有降低血脂、降低血壓、預(yù)防動脈粥樣硬化、抵抗衰老、增強(qiáng)腸道蠕動，幫助消化等多種功效[2]；陳皮作為一味傳統(tǒng)的中藥材，具有多種藥用價值，主治消化不良、食欲不振、嘔吐、咳嗽等[3-4]。陳皮和普洱茶所富含的黃酮成分對其功效起關(guān)鍵作用，黃酮是自由基清除劑，可以預(yù)防心血管疾病，能夠降低血脂、血糖，有助于提高血液循環(huán)和脂質(zhì)代謝，對炎癥反應(yīng)也有抑制作用[5]。黃酮的生理活性與其抗氧化性密切相關(guān)[6]。陳皮中的黃酮主要是柚皮苷、橙皮苷等二氫黃酮苷類和桔皮素、川陳皮素等多甲氧基黃酮類[7-8]；普洱茶中的黃酮主要是蘆丁、槲皮素、芹菜素、山奈酚、金絲桃苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷等黃酮醇和黃酮醇苷類[6]。陳皮和普洱茶中含有的黃酮亞類不同，復(fù)配后的抗氧化活性可能發(fā)生變化[9-10]。研究陳皮、普洱茶總黃酮復(fù)配溶液的抗氧化活性，可以為柑普茶的功效評價和加工工藝提供理論參考。本試驗(yàn)取大紅柑柑普茶為原料，將陳皮、普洱茶總黃酮按照濃度比 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3混合[9-10]（以下濃度比均為陳皮總黃酮∶普洱茶總黃酮），測定混合前后樣品總黃酮和 VC對·OH、ABTS＋·、DPPH自由基清除能力和總還原力。應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析陳皮、普洱茶總黃酮是否具有協(xié)同抗氧化功效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五年柑普茶：廣東省江門市新會區(qū)茶坑村，由新會陳皮協(xié)會提供；蘆丁、VC標(biāo)準(zhǔn)品（批次號分別為P10A6F2261、H09M7K14409）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS（分析純）、AB-8 大孔樹脂：上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵、鄰羥基苯甲酸、雙氧水、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pH 6.6 磷酸緩沖液：上海雷磁化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（e2695）：美國waters 公司；紫外可見分光光度計（752S）：浙江賽德儀器有限公司；超聲波儀（KQ5200E）：北京海天友誠科技有限公司；落地式高速冷凍離心機(jī)（GL-2050M）：上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-III）：上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（WE-1）：天津市歐諾儀器儀表有限公司；精密增力電動攪拌器（JJ-1）：常州國華電器有限公司；二兩裝高速萬能粉碎機(jī)（QE-100）：浙江屹立工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取0.5 g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用80%乙醇溶解并定容至100 mL，取10 mL 該溶液，用80%乙醇再次定容至100 mL，得到0.5 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，添加80%乙醇至0.5 mL。分別向各試管中加入5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL，靜置6 min 后，加入10%硝酸鋁溶液0.15 mL，靜置6 min 后，加4%氫氧化鈉溶液2 mL，加蒸餾水至待測混合液總體積為5 mL，振蕩混勻后靜置3 min，于508 nm 處測定吸光度值，測定3 次取均值，將吸光度作為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

1.3.2 樣品提取方法

取大紅柑柑普茶，剝?nèi)ゴ蠹t柑柑皮即為新會廣陳皮，取出普洱茶，將陳皮和普洱茶用萬能粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩，得到陳皮粉末和普洱茶粉末，用密封袋封好備用。取陳皮和普洱茶粉末各500 mg，分別加入300 mL，80%乙醇溶液，于溫度40 ℃，超聲功率420 W條件下超聲30 min，將提取液于8 000 r/min 離心10 min，收集濾液。向?yàn)V渣中加入80%乙醇溶液，重復(fù)以上操作兩次，收集濾液即為黃酮粗提液，將粗提液旋蒸至不含乙醇。將新購的AB-8 樹脂置于蒸餾水中浸泡16 h，取直徑為20 mm，高300 mm 的層析柱，將60 mL浸泡后的AB-8 樹脂濕法裝柱，以2 mg/mL 的粗提液上柱，粗提液處理量為3 BV/次，用蒸餾水洗柱，流速為1 BV/h，蒸餾水用量為4 BV/次，脫附劑為80%乙醇，脫附劑流速為1 BV/h，用量為2 BV/次[12]。收集純化后的黃酮溶液，旋蒸至不含乙醇，得到待測樣液[12-13]。

1.3.3 樣品中黃酮含量的測定

參考李夢杰等[14]的方法，適當(dāng)調(diào)整。于試管中分別加入0.2 mL 樣品提取液，分別向各試管中加入5%亞硝酸鈉溶液0.15 mL，靜置6 min 后，加入10%硝酸鋁溶液0.15 mL，靜置6 min 后，加4%氫氧化鈉溶液2 mL，加蒸餾水2.5 mL 后混合液總體積為5 mL，振蕩混勻后靜置3 min，于508 nm 處測定吸光度值，測定3 次取均值。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得到樣品黃酮濃度。

1.3.4 DPPH 自由基清除率測定

參考馬雙雙等[12]的方法，用80%乙醇配制總黃酮濃度分別為 1、2.5、5、10、20、50 μg/mL 的總黃酮溶液（陳皮總黃酮濃度 ∶普洱茶總黃酮濃度 = 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3），用蒸餾水配置相應(yīng)濃度的VC溶液，各取2 mL于具塞試管中，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，振蕩搖勻，25 ℃下避光反應(yīng)30 min，測定反應(yīng)樣液在517 nm 處吸光值A(chǔ)i，以2 mL 無水乙醇代替 2 mL DPPH 溶液，測定吸光度值A(chǔ)j，以2 mL 無水乙醇代替2 mL 樣品溶液，測定吸光度值A(chǔ)0，平行測定3 次取均值，計算DPPH 自由基清除率的公式為：

1.3.5 ABTS+·清除率測定

將 10mL、7mmol/L 的 ABTS 溶液和 10mL、4.9mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，振蕩搖勻，25 ℃遮光保存18 h，得到ABTS+·儲備液，保存于4 ℃冰箱。使用時取儲備液稀釋至734 nm 處的吸光度值為0.7±0.02，現(xiàn)配現(xiàn)用[15]。參考李學(xué)玲等[16]的方法，用80%乙醇配制總黃酮濃度分別為 5、10、20、50、100 μg/mL 的總黃酮溶液（陳皮總黃酮濃度 ∶普洱茶總黃酮濃度 = 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3），并用蒸餾水配置相應(yīng)濃度的VC溶液。將所有樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)液各取200 μL 于試管中，加入4 mL ABTS+·溶液，振蕩搖勻，25 ℃下避光反應(yīng) 6 min，于 734 nm 處測定反應(yīng)液的吸光度值A(chǔ)w，以4 mL 無水乙醇代替 4 mL ABTS+·溶液，測定吸光度值 Ae，以 200 μL 無水乙醇代替200 μL 樣品溶液，測定吸光度值A(chǔ)q，測定3 次取均值。計算ABTS+·清除率的公式為：

1.3.6 還原能力測定

參考Bushra N 等[5]的方法，測定不同濃度比的柑普茶總黃酮提取液總還原力。取1 mL 質(zhì)量濃度分別為 20、40、60、80、100 μg/mL 的總黃酮溶液（陳皮總黃酮濃度 ∶普洱茶總黃酮濃度 = 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3） 和 VC溶液，依次加入0.2 mol/L 的H3PO4緩沖溶液（pH6.6）和 1%的 K3[Fe（CN）6]溶液各 2 mL，置于 50 ℃水浴鍋中0.5 h，加入2 mL 質(zhì)量濃度10%的三氯乙酸溶液，振蕩搖勻，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min 下離心10 min，快速取2 mL 上清液，向上清液中加入0.5 mL 濃度0.1 %的FeCl3溶液和2 mL 蒸餾水，靜置10 min 后搖勻，測定其在700 nm 波長處的吸光度值，3 次測定取均值。

1.3.7 羥自由基（·OH）清除作用測定

參考孫濤濤[17]的方法，測定不同質(zhì)量比柑普茶黃酮清除羥自由基作用。取1 mL 不同濃度的總黃酮溶液（陳皮總黃酮濃度∶普洱茶總黃酮濃度= 3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3）和VC溶液于試管中，質(zhì)量濃度分別為200、400、600、800、1 000 μg/mL，依次加入 9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L 鄰羥基苯甲酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各 1 mL，混勻，保持溫度 38 ℃反應(yīng) 50 min，測定樣品溶液在510 nm 處的吸光度值記為A1；將H2O2用等體積蒸餾水替換，測定510 nm 處的吸光度值并記為A2，將樣品溶液用等體積蒸餾水替換，于510 nm處測定吸光度值并記為A0，3 次測定取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 進(jìn)行Probit 回歸分析，計算自由基的半清除率濃度IC50值。

試驗(yàn)確定復(fù)配溶液半清除濃度IC50mix，兩個復(fù)配組分沒有相互作用時的理論IC50值為IC50add。通過t 檢驗(yàn)分析復(fù)配溶液的IC50add和IC50mix是否有顯著性差異。若IC50mix＜IC50add且差異顯著，說明二者具有協(xié)同抗氧化作用[10]。

式中：P1、P2分別為陳皮總黃酮和普洱茶總黃酮在復(fù)配組中占的比例，P1+P2=1；R 為陳皮、普洱茶總黃酮的清除能力效價比，R=IC50A/IC50B（A、B 分別代表陳皮和普洱茶）。

通過相互作用指數(shù)（γ）來表征陳皮和普洱茶總黃酮相互作用的程度，判別其相互作用是協(xié)同、拮抗還是加和[10]。

式中：IC50Amix、IC50Bmix分別為復(fù)配溶液中陳皮、普洱茶總黃酮的IC50權(quán)重值（IC50Amix=IC50mix·P1；IC50Bmix=IC50mix·P2）；IC50A、IC50B分別為陳皮總黃酮、普洱茶總黃酮單獨(dú)作用時的 IC50。相互作用指數(shù) γ=1、γ＞1，和 γ＜1 分別表示陳皮、普洱茶總黃酮間相互作用為加和、拮抗和協(xié)同作用。γ 值小于1 時，其值越小表明協(xié)同相互作用越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑普茶中陳皮總黃酮和普洱茶總黃酮含量的測定

根據(jù)1.3.1 的試驗(yàn)方法，得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.816 5X-0.009 2，R2=0.999 5，顯著線性相關(guān)，按照1.3.3 的試驗(yàn)方法測定柑普茶黃酮在508 nm 處吸光度值，并對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，新會陳皮總黃酮含量為30.126 mg/g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.01%，普洱茶的總黃酮含量為30.58 mg/g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.06%。

2.2 柑普茶黃酮清除DPPH 自由基能力

DPPH 自由基的乙醇溶液呈深紫色，測定其517 nm處吸光度值，可以比較DPPH 濃度高低。向DPPH 醇溶液中加入柑普茶黃酮后，若紫色變淺，則說明柑普茶黃酮具有清除DPPH 自由基的功效，比較517 nm 處吸光度值越低，則說明加入的物質(zhì)清除能力越強(qiáng)[18]。不同質(zhì)量濃度比的陳皮黃酮和普洱茶黃酮溶液和陽性對照VC清除DPPH 自由基能力如圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度比柑普茶黃酮DPPH 自由基清除率曲線Fig.2 The DPPH free radical scavenging ability of total flavnoids in tangerine peel Pu'er tea of different concentration ratio

由圖2 可知，隨著抗氧化劑濃度增加，DPPH 自由基清除率增大且逐漸趨于平緩。經(jīng)SPSS 分析可知，DPPH 自由基半清除濃度由小到大依次為3 ∶1（IC50=2.54 μg/mL）＜1 ∶1（IC50= 2.59 μg/mL）＜1 ∶3（IC50=2.74 μg/mL）＜普洱（IC50= 4.65 μg/mL）＜陳皮（IC50=4.91 μg/mL）＜VC（IC50=5.41 μg/mL）。IC50值越小說明自由基清除能力越強(qiáng)，將除VC外的各組抗氧化劑的IC50值在95%置信區(qū)間進(jìn)行t 檢驗(yàn)，顯示各組IC50值間有顯著性差異。DPPH 自由基半清除濃度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表1。

表1 DPPH 自由基半清除濃度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果Table 1 Statistical analysis results of IC50 of DPPH free radical

由表1 可知，各復(fù)配比例下的IC50mix值均小于IC50add值，在95%置信區(qū)間進(jìn)行t 檢驗(yàn)，均有顯著性差異。各組γ 值均小于1，表明陳皮與普洱茶總黃酮具有協(xié)同清除DPPH 自由基的功效。γ 值越小則協(xié)同作用越強(qiáng)，協(xié)同作用排序?yàn)?1 ∶1=1 ∶3＞3 ∶1。

2.3 柑普茶黃酮清除ABTS+·能力

將柑普茶黃酮加入到ABTS+·溶液后，如果734 nm的吸光度降低，則說明柑普茶黃酮可以清除ABTS+·，有抗氧化的功效。比較吸光度值降低程度可以評價不同質(zhì)量濃度比柑普茶黃酮的抗氧化能力強(qiáng)弱，清除能力越強(qiáng)則對應(yīng)吸光度值越小[19]。不同質(zhì)量濃度比的柑普茶黃酮溶液和陽性對照VC清除ABTS+·的能力如圖3 所示。

圖3 不同質(zhì)量濃度比柑普茶黃酮ABTS+·清除率曲線Fig.3 The ABTS＋·free radical scavenging ability of total flavnoids in tangerine peel Pu'er tea of different concentration ratio

由圖3 可知，隨著抗氧化劑濃度增加，ABTS+·清除率增大且逐漸趨于平緩。經(jīng)SPSS 分析可知，ABTS+·半清除濃度由小到大依次為 3 ∶1（IC50=9.74 μg/mL）＜1 ∶1（IC50=11.35 μg/mL）＜1 ∶3（IC50=12.97 μg/mL）＜陳皮（IC50=13.96 μg/mL）＜普洱（IC50=14.56 μg/mL）＜VC（IC50=19.65 μg/mL）。IC50值越小說明自由基清除能力越強(qiáng)，將除VC外的各組抗氧化劑的IC50值在95%置信區(qū)間進(jìn)行t 檢驗(yàn)，顯示各組IC50值間有顯著性差異。ABTS+·半清除濃度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表2。

表2 ABTS+·半清除濃度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果Table 2 Statistical analysis results of IC50 of ABTS+·

由表2 可知，各復(fù)配比例下的IC50mix值均小于IC50add值，在95%置信區(qū)間進(jìn)行t 檢驗(yàn)，均有顯著性差異。各組γ 值均小于1，表明陳皮與普洱茶總黃酮具有協(xié)同清除ABTS+·的功效。γ 值越小則協(xié)同作用越強(qiáng)，協(xié)同作用排序?yàn)?3 ∶1＞1 ∶1＞1 ∶3。

2.4 不同質(zhì)量濃度比柑普茶黃酮清除·OH能力

羥自由基有很強(qiáng)的氧化性，會引起脂質(zhì)鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)[20]，研究柑普茶黃酮清除·OH 的能力，很好的反映了其抗氧化能力。不同質(zhì)量濃度比的柑普茶黃酮和VC陽性對照清除羥自由基的能力如圖4 所示。

由圖4 可知，隨著抗氧化劑濃度增加，·OH 清除率增大。經(jīng)SPSS 分析可知，·OH 半清除濃度由小到大依次為 3 ∶1（IC50=386.85 μg/mL）＜1 ∶1（IC50=427.56 μg/mL）＜1 ∶3（IC50=447.21 μg/mL）＜普洱（IC50=497.37 μg/mL）＜陳皮（IC50=499.77 μg/mL）＜VC（IC50=1 076.21 μg/mL）。IC50值越小說明自由基清除能力越強(qiáng)，將除VC外的各組抗氧化劑的IC50值在95%置信區(qū)間進(jìn)行t 檢驗(yàn)，顯示各組IC50值間有顯著性差異?！H 半清除濃度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表3。

圖4 不同質(zhì)量濃度比柑普茶黃酮羥自由基清除率曲線Fig.4 The hydroxyl radical scavenging ability of total flavonoids in tangerine peel Pu'er tea of different concentration ratios

表3 ·OH 半清除濃度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis results of IC50 of·OH

由表3 可知，各復(fù)配比例下的IC50mix值均小于IC50add值，在95%置信區(qū)間進(jìn)行t 檢驗(yàn)，均有顯著性差異。各組γ 值均小于1，表明陳皮與普洱茶總黃酮具有協(xié)同清除·OH 的功效。γ 值越小則協(xié)同作用越強(qiáng)，協(xié)同作用排序?yàn)?3 ∶1＞1 ∶1＞1 ∶3。

2.5 柑普茶總黃酮還原能力

通過測定柑普茶總黃酮的還原能力，可以反映其潛在抗氧化能力?？傔€原能力可以表征物質(zhì)供給電子的能力，供給電子的還原劑通過還原氧化性物質(zhì)，使氧化性強(qiáng)的物質(zhì)變成氧化性弱的穩(wěn)定物質(zhì)[21]。不同質(zhì)量濃度比的柑普茶黃酮與陽性對照VC的總還原能力如圖5 所示。

圖5 不同質(zhì)量濃度比柑普茶黃酮總還原力曲線Fig.5 The total reduction capacity of total flavonoids in tangerine peel Pu'er tea of different concentration ratios

由圖5 可知，3 ∶1 復(fù)配的黃酮溶液，在各濃度下吸光度值均高于其他組，總還原力最強(qiáng)。復(fù)配組的曲線始終保持在單一陳皮和普洱茶總黃酮組的上方，說明復(fù)配后的黃酮溶液總還原力更強(qiáng)。同濃度條件下吸光度越大的總還原力越強(qiáng)，因此圖像按照由上至下為總還原力由大到小，排序?yàn)?3 ∶1＞1 ∶3＞1 ∶1＞陳皮＞普洱＞VC。

3 討論

根據(jù)研究結(jié)果可知，柑普茶分離所得陳皮和普洱茶中都含有豐富的黃酮，抗氧化功效均優(yōu)于VC。各組自由基清除率試驗(yàn)中相互作用指數(shù)（γ）均小于1，IC50mix均小于IC50add且有顯著性差異，表明陳皮總黃酮與普洱茶總黃酮具有協(xié)同抗氧化作用，且不同的復(fù)配比對同種自由基的清除效果有差異，不同的自由基對應(yīng)的最佳復(fù)配比也不同，這可能是由于陳皮、普洱茶總黃酮之間的抗氧化相互作用與復(fù)配黃酮的結(jié)構(gòu)和濃度有關(guān)，不同復(fù)配比影響反應(yīng)體系中分子間的相互作用，導(dǎo)致抗氧化效力的差異。本文僅考察了3 種濃度比，數(shù)據(jù)量不夠，比例間隔較大，存在一定誤差，還需要大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步優(yōu)化，且體外抗氧化作用不能模擬其在人體內(nèi)的功效，為評價柑普茶中陳皮和普洱茶總黃酮對人體健康的協(xié)同功效，需要通過設(shè)計動物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。