腰果葉多酚超聲波輔助提取工藝及其抗氧化能力測(cè)定

王彥陽，張中潤(rùn)，鄭曉瑞，高燕

（1.江門職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東江門529090；2.廣東省綠色高性能新材料研發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東江門529090；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州571737；4.廣東省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，廣東廣州510640）

腰果（Anacardium occidentale L.）原產(chǎn)巴西東北部地區(qū)，在我國(guó)已有80 多年的引種栽培歷史，我國(guó)海南西南和東南部，云南西雙版納都有引種栽培，是我國(guó)熱帶地區(qū)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、用途十分廣泛的珍貴植物[1]。腰果具有非常高的營(yíng)養(yǎng)藥用和保健價(jià)值[2]，腰果酸對(duì)乳腺癌、宮頸癌有治療效果，可從食用的腰果樹果中分離出來，長(zhǎng)期食用腰果果托或果汁可以控制腫瘤的生長(zhǎng)，腰果中含有的脂肪有很好的軟化血管作用，對(duì)保護(hù)血管、防治心血管疾病大有益處[3]，有研究顯示濃縮腰果蛋白可作為營(yíng)養(yǎng)添加劑添加入食品中[4]。目前有關(guān)腰果的研究集中在腰果蛋白的提取及其特性[5-9]、腰果脂肪提取工藝及腰果加工的報(bào)道[10-13]，而對(duì)腰果多酚研究較少。響應(yīng)面分析因其直觀地反映了各影響因素情況，效果優(yōu)于單因素試驗(yàn)[14]。本研究基于響應(yīng)面法，對(duì)超聲波提取腰果葉多酚進(jìn)行了工藝條件優(yōu)化，同時(shí)對(duì)腰果多酚進(jìn)行了抗氧化性效應(yīng)研究，為進(jìn)一步研究腰果葉多酚提供依據(jù)，使腰果得到進(jìn)一步開發(fā)和利用。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

腰果葉：海南省東方市新龍鎮(zhèn)腰果園；沒食子酸（分析純）：上海研深實(shí)業(yè)有限公司；福林酚試劑（分析純）：美國(guó) Sigma 公司；DPPH、抗壞血酸、ABTS、FeCl3、K3[Fe（CN）6]、二丁基羥基甲（butylated hydroxytoluene，BHT）、C2HCl3O2、無水乙醇（均為分析純）：東莞市萬信精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-5200DTS 超聲波清洗儀：上海金鵬分析儀器有限公司；LGJ-10 冷凍干燥機(jī)：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；Wo-600A 微型高速粉碎機(jī)：山東百百順儀器設(shè)備有限公司；E80 精細(xì)電子天平：天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；MS2200E 數(shù)字超聲波清洗儀：上海遂歐儀器有限公司；Hh2004 超靜離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；R-1300D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，參照Folin-Ciocalteu 法略有修改[15]。用少量蒸餾水溶解并定容0.50 g 沒食子酸至100 mL 得對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 置于 8 個(gè) 50 mL容量瓶中定容。取上述溶液各0.5 mL 與1.25 mL 福林酚試劑搖勻后靜置反應(yīng)1 min，加入3.75 mL20%無水碳酸鈉溶液，定容至25 mL，30 ℃下靜置1.5 h 后測(cè)定其在765 nm 處的吸光度。

1.3.2 腰果葉多酚含量提取及測(cè)定

一定體積分?jǐn)?shù)溶劑下，按一定溫度及超聲波處理時(shí)間萃取腰果葉粉末1.0 g 后得到粗提液。將粗提液5 000 r/min 離心5 min 后取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除乙醇后用蒸餾水定容至100 mL 得腰果葉多酚提取液，4 ℃避光保存。取25 mL 腰果葉多酚提取液定容至50 mL，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算公式如下：

式中：W 為腰果葉多酚的提取率，%；M1為提取的腰果葉多酚的質(zhì)量，g；M2為腰果葉的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1）丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)腰果葉多酚提取率的影響：固定提取多酚時(shí)間為20 min，提取多酚溫度為30 ℃，料液比為 1 ∶20（g/mL），考察丙酮體積分?jǐn)?shù)為 25%、35%、45%、55%、65%、75%對(duì)腰果葉多酚提取率的影響。

2）提取溫度對(duì)腰果葉多酚提取率的影響：固定提取多酚時(shí)間為20 min，丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為 1 ∶20（g/mL），考察溫度 30、40、50、60、70、80 ℃對(duì)腰果葉多酚提取率的影響。

3）超聲波處理時(shí)間對(duì)腰果葉多酚提取率的影響：固定提取多酚溫度為30 ℃，丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為 1 ∶20（g/mL），考察超聲波處理時(shí)間 30、50、70、90、110、130 min 對(duì)腰果葉多酚提取率的影響。

4）料液比對(duì)腰果多酚提取率的影響：固定提取多酚時(shí)間為20 min，提取多酚溫度為30 ℃，丙酮體積分?jǐn)?shù)為 50%，考察料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）對(duì)腰果葉多酚提取率的影響。

1.3.4 Box－Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、超聲波處理時(shí)間（C）3 個(gè)因素，分別考察其單獨(dú)作用時(shí)對(duì)腰果葉多酚提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取3 個(gè)對(duì)多酚提取率影響較大的水平，利用Design－Expert8.0 軟件建立因素和水平均為3 的響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Benhnken 模型，以丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、超聲波處理時(shí)間（C）為自變量，腰果葉多酚提取率為響應(yīng)值（Y）。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Three factors and three levels of test design

1.3.5 腰果葉多酚抗氧化效應(yīng)

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

將腰果多酚提取液用蒸餾水稀釋至不同濃度，取5.0 mL 與 5.0 mLDPPH（1 mmol/L）溶液混合后避光靜置 30 min，于 517 nm 處測(cè)定吸光值（n1）[16-17]。同時(shí)測(cè)定5.0 mL 蒸餾水與 5.0 mLDPPH 溶液、5.0 mL 相應(yīng)濃度提取液與5.0 mL 無水乙醇的517 nm 光吸收值（用n2、n3表示）。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（n1-n3）/n2]×100

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

將 5.0 mL 7 mmol/L 的 ABTS+溶液與 88.0 μL 140 mmol/L 的 K2S2O8混合后于避光反應(yīng) 12 h～16 h 得到ABTS+備用液。參照周曄[18]等方法，將備用液用70%乙醇稀釋得ABTS+工作液。分別取不同濃度腰果總酚提取液 ABTS+工作液按 0.1 ∶3.9 體積比混合，室溫 25 ℃避光反應(yīng) 6 min～10 min 后測(cè)定吸光值（A樣品）；以蒸餾水和ABTS+工作液混合進(jìn)行空白試驗(yàn)（A空白）。

ABTS+自由基清除率/%=（A空白－A樣品）/A空白×100

1.3.5.3 鐵還原力測(cè)定

取 pH 值為 6.6 磷酸緩沖液 1 mL，加入 200 μL 腰果多酚提取液、10 mL 鐵氰化鉀溶液（1 g/L）后50 ℃恒溫水浴20 min；加入1 mL 10 %的三氯乙酸溶液2 500 r/min離心20 min 取上層清液2 mL；加入1 mL 三氯化鐵溶液（1 g/L）、2.0 mL 蒸餾水，振蕩混勻，700 nm處測(cè)定光吸收值。以同濃度的VC為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素試驗(yàn)做3 次平行，用One-WayANOVA 進(jìn)行方差分析，采用Tukey’s multiple range test 檢驗(yàn)各處理間的差異，顯著水平P=0.05，具有不同英文小寫字母表示差異顯著。腰果葉多酚抗氧化效采用成對(duì)樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，顯著水平P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

經(jīng)過對(duì)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度和765 nm 波長(zhǎng)處吸光度A 有關(guān)數(shù)據(jù)的記錄和分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

通過測(cè)定，沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光值A(chǔ) 之間的曲線回歸方程為 y=0.001 9x+0.088 6（R2=0.975），線性關(guān)系良好。腰果多酚提取物含量測(cè)定能根據(jù)此方程計(jì)算得到。

2.2 腰果葉多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)腰果葉多酚得率的影響

丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)腰果葉多酚得率的影響見圖2。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

圖2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)腰果葉多酚得率的影響Fig.2 Effects of acetone volume fraction on extraction yield of polyphenols

由圖2 可知，丙酮體積分?jǐn)?shù)為55%、65%時(shí)，對(duì)腰果葉多酚提取率為9.49%、9.31%，與其他體積分?jǐn)?shù)形成顯著差異，表明丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)腰果葉多酚提取率有影響。丙酮體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)多酚提取率達(dá)到最大值，隨后有所下降，原因可能是丙酮體積分?jǐn)?shù)過高，脂溶性物質(zhì)溶出增大，從而影響了腰果葉多酚的提取率。因此選擇丙酮體積分?jǐn)?shù)為55%作為最佳提取條件。

2.2.2 提取溫度對(duì)腰果葉多酚得率的影響

提取溫度對(duì)腰果葉多酚得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)腰果葉多酚得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of polyphenols

由圖3 可知，提取溫度為 50、60、70 ℃時(shí)，對(duì)腰果葉多酚提取率為8.35%、8.85%、8.68%，與其他提取溫度形成顯著差異，表明提取溫度對(duì)腰果葉多酚提取率有影響。60 ℃以下溫度提取率與溫度呈正相關(guān)，60℃以上提取率與溫度呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)是溫度上升對(duì)多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)造成了影響，從而降低了提取率。綜合考慮原料和試劑消耗等因素，選取為提取溫度50、60、70 ℃用于響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)腰果葉多酚得率的影響

超聲波處理時(shí)間對(duì)腰果葉多酚得率的影響見圖4。

圖4 超聲波處理時(shí)間對(duì)腰果葉多酚得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment time on extraction yield of polyphenols

由圖4 可知，超聲波處理時(shí)長(zhǎng)為70、90、110 min時(shí)，對(duì)腰果多酚提取率為8.53%、8.70%、8.43%，與其他超聲波處理為時(shí)間形成顯著差異，表明超聲波處理為時(shí)間對(duì)腰果葉多酚提取率有影響。處理時(shí)間超過90 min 多酚提取率呈下降趨勢(shì)，推測(cè)是超聲波長(zhǎng)時(shí)間作用使部分多酚分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多酚提取率降低。綜合考慮原料和試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)等因素，選取超聲波處理時(shí)長(zhǎng)70、90、110 min 用于響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2.4 料液比對(duì)腰果葉多酚得率的影響

料液比對(duì)腰果葉多酚得率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)腰果葉多酚得率的影響Fig.5 Effects of solid to liquid ratio on extraction yield of polyphenols

結(jié)果表明，料液比對(duì)腰果多酚提取率的影響差異不顯著。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

運(yùn)用Desert-expert8.0.1 設(shè)計(jì)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2，模型方程方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

腰果葉多酚提取率與丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、超聲波處理時(shí)間（C）之間的二次多項(xiàng)式模型為：

Y=37.515 75+0.461 6A + 0.364 2B + 0.531 2C -0.000 2AB+0.000 65AC + 0.000 175BC - 0.003 81A2-0.002 91B2-0.003 09C2。

回歸模型 P＜0.000 1，失擬項(xiàng) P=0.290 5＞0.05，模型具有高度的顯著性，對(duì)腰果葉多酚提取率有充分的理論預(yù)測(cè)。模型系數(shù)R2=0.986 0，提取溶劑、溫度、超聲波處理時(shí)間與提取率之間的真實(shí)關(guān)系在方程上體現(xiàn)出來。模型的變異率不到1.5%，可采用此模型確定丙酮體積分?jǐn)?shù)、超聲波作用時(shí)間、提取溫度最佳提取工藝條件。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明：對(duì)多酚提取率影響主次順序依次為：丙酮體積分?jǐn)?shù)＞超聲波作用時(shí)間＞提取溫度。因素 A 和 A2、B2、C2對(duì)多酚提取效果的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.01）。

2.4 體積分?jǐn)?shù)、溫度、超聲波作用時(shí)間交互作用分析

丙酮體積分?jǐn)?shù)、溫度、超聲波作用時(shí)間響應(yīng)曲面見圖6。

圖6 丙酮體積分?jǐn)?shù)、溫度、超聲波作用時(shí)間響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot of acetone volume fraction，temperature and ultrasonic response time

交互作用曲面比較平滑的為AB，接近圓形的等高線，交互作用曲面比較陡峭的為AC 和BC，偏向橢圓的等高線，根據(jù)表3 顯著性可知AB、AC 和BC 交互作用均不顯著（P＞0.05）。

2.5 驗(yàn)證模型及條件確定

腰果葉多酚提取的最優(yōu)工藝條件為丙酮體積分?jǐn)?shù)57.90%、提取溫度58.79 ℃、超聲波處理時(shí)間89.49 min，此時(shí)響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)提取率為10.33%。為簡(jiǎn)化操作，選丙酮濃度60%，提取溫度60 ℃，超聲輔助提取時(shí)間90 min，按此條件進(jìn)行5 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，多酚提取率平均值為10.29%，接近模型預(yù)測(cè)值10.33%，說明該模型可運(yùn)用在實(shí)踐中。

2.6 腰果葉多酚抗氧化效應(yīng)

2.6.1 腰果葉多酚對(duì)DPPH 自由基清除效應(yīng)

腰果葉多酚提取物和VC對(duì)DPPH 自由基清除能力見圖7。

圖7 腰果葉多酚提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.7 DPPH free radical clearance rate by polyphenol extract from cashew leaves

腰果葉多酚提取物對(duì)DPPH 自由基清除率隨濃度升高而加大，當(dāng)腰果葉多酚提取物濃度為5 mg/L 時(shí)，清除率為62%。腰果多酚提取物對(duì)DPPH 自由基的清除效應(yīng)比同濃度的VC高，自由基清除效果較好。

2.6.2 腰果葉多酚對(duì)ABTS+自由基清除效應(yīng)

腰果葉多酚提取物和VC對(duì)ABTS+自由基清除能力見圖8。

圖8 腰果葉多酚提取物對(duì)ABTS+的清除率Fig.8 ABTS+free radical clearance rate

腰果葉多酚提取物對(duì)ABTS+自由基的清除效應(yīng)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，最高清除率為82%。各組濃度下，腰果葉多酚提取物對(duì)ABTS+自由基的清除效應(yīng)比同濃度的VC高，自由基清除效果較好。

2.6.3 還原力測(cè)定

腰果葉多酚提取物還原力測(cè)定見圖9。

圖9 Fe3+還原力測(cè)定Fig.9 Fe3+reducing power determination

通過測(cè)定鐵離子的還原力來表示腰果葉多酚提取物抗氧化活性的強(qiáng)弱。相同濃度下腰果葉多酚提取物的還原力均高于VC。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過超聲波輔助提取腰果葉多酚并對(duì)其抗氧化作用進(jìn)行探討。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化腰果葉多酚提取工藝。優(yōu)化結(jié)果為丙酮體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度80 ℃，超聲波處理時(shí)間時(shí)間90 min，在此條件下腰果葉多酚提取率為10.29%，與10.33%的預(yù)測(cè)值接近。通過腰果葉多酚提取物對(duì)DPPH 自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，鐵離子還原能力，得出腰果葉多酚提取物具有抗氧化能力，抗氧化性高于同濃度天然VC，對(duì)研究腰果葉多酚的有效開發(fā)具有一定意義。