牛至、香茅、丁香精油化學(xué)成分及體外抑菌活性研究

牛彪，金川，梁劍平，尚若鋒，郝寶成，王學(xué)紅，楊珍，劉宇，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050；2.定西市安定區(qū)畜牧獸醫(yī)局白碌畜牧獸醫(yī)站，甘肅定西743026）

近年來，細(xì)菌耐藥性及藥物殘留的日益加重，嚴(yán)重影響著食品安全及人類健康，已成為全球性話題。植物精油（plant essential oil）是存在于植物中的一類具有芳香氣味、可隨水蒸氣蒸餾出來而又與水不相混溶的揮發(fā)性油狀成分的總稱，是天然植物和香料的精華，是植物的次生代謝產(chǎn)物[1]。全球精油品種3000 種以上[2]，具有商業(yè)價(jià)值的多達(dá)數(shù)百種。植物精油具有很強(qiáng)的廣譜抑菌殺菌、抗氧化、抗炎癥和促生長的作用[3-6]，此外，精油在腸道菌群平衡調(diào)節(jié)、新型飼料添加劑產(chǎn)品的研發(fā)、養(yǎng)殖場環(huán)境控制等方面具有可期待性[7]。近年來，越來越多的研究人員從天然植物中尋找抗生素替代品，使得植物精油有望成為一種可緩解全球抗菌藥物危機(jī)的天然抗菌劑[8-10]，得到了廣大科研工作者的青睞。植物精油對(duì)常見微生物的殺滅性及在獸藥耐藥性及殘留方面均比化學(xué)藥品有顯著的優(yōu)越性，具有廣泛的開發(fā)利用前景。本文主要通過測(cè)定常見3 種植物精油及其有效成分對(duì)常見病原微生物的體外抑菌活性，分析其化學(xué)成分，為植物精油在基礎(chǔ)獸藥產(chǎn)品中的研究開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

HF-safe 生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；HNYC-202T 恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；Agilent 6890/5973 氣相質(zhì)譜儀：美國安捷倫科技公司；BS-90-D 培養(yǎng)皿：蘭州博樂知生物科技有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.1.2 菌株

埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli，CICC10389）、白色念珠菌（Candida albicans，CICC1965）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，CICC10384）、白色葡萄球菌（Staphyloccocus albus，CICC10897）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CICC10419）：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要試劑

牛至、香茅、丁香精油：廣州花神生物科技有限公司；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基：海博生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、MH（A）培養(yǎng)基、MH（B）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：萊陽化工實(shí)驗(yàn)廠；正己烷（色譜級(jí)）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濾紙片（d=6 mm）：甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)121 ℃高壓風(fēng)干后待用。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將低溫斜面保存的菌種先置于25 ℃左右約0.5 h后，用接種環(huán)劃線將白色念珠菌接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，將其余4 種菌株接種至MH（A）培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，從上述培養(yǎng)基上挑取單菌落用無菌生理鹽水稀釋至0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海? CFU/mL～5×108CFU/mL），用倍比稀釋法稀釋至所需濃度（1 CFU/mL～5×106CFU/mL）[11]，備用。

1.2.2 抑菌圈直徑的測(cè)定

取菌懸液150 μL，用涂布棒均勻涂于平板中，用無菌鑷子夾取濾紙片于培養(yǎng)基表面，采取3 個(gè)試驗(yàn)組和1 個(gè)陰性對(duì)照組，使得各濾紙片間距離相等。然后在試驗(yàn)組濾紙片上加上5 μL 精油，陰性對(duì)照組加入5 μL無菌生理鹽水，緩慢蓋住平皿，白色念珠菌28 ℃培養(yǎng)48 h，其余細(xì)菌放在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)以上精油對(duì)上述病原菌的抑菌圈直徑[12]。

1.2.3 最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測(cè)定

由于植物精油與培養(yǎng)液不相溶，采用DMSO 為助溶劑，根據(jù)文獻(xiàn)顯示[13]：DMSO/植物精油=1 ∶19 的體積比時(shí)DMSO 對(duì)待測(cè)試菌的生長無影響。將其稱為精油乳劑。按上述比例各先配制牛至精油乳劑5 mL，然后采用肉湯稀釋法及點(diǎn)種法來測(cè)定MIC 及MBC，具體為取一系列試管，分別標(biāo)號(hào)1，…，10，將已滅菌試管每排9 支分別編號(hào) 1，2，…9 號(hào)，排成 5 排于超凈臺(tái)，向前 4排每支試管中加入1 mL MH（B）液體培養(yǎng)基，第5 排每支試管中加入1 mL 改良馬丁培養(yǎng)基，分別吸取牛至精油乳劑1 mL 于5 排中的第1 號(hào)試管，連續(xù)吹打混勻后采用倍比稀釋法取1 mL 至每排中第2～6 號(hào)試管制成不同濃度的牛至精油乳劑，再向其中每支試管中加入3.8 mL 相對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基，每一排對(duì)應(yīng)一個(gè)菌種并依次標(biāo)注，然后取200 μL 菌懸液于相應(yīng)的試管中。因此，每排前6 號(hào)試管中含有的牛至精油濃度分別為9.5%、4.75%、2.375%、1.188%、0.594%、0.297%，第 7號(hào)不加乳化劑做陽性對(duì)照，8、9 號(hào)不加菌液做液體培養(yǎng)基及空白對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3 次，將前4 排試驗(yàn)完的試管放入37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩培養(yǎng)24 h，第5 排試管放入28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。到相應(yīng)時(shí)間后從各試管中取200 μL 于已倒好的相應(yīng)培養(yǎng)基，涂勻后再培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間后數(shù)菌落個(gè)數(shù)，平皿中菌落數(shù)≤5 對(duì)應(yīng)的牛至精油濃度為該菌的MIC，將各試管繼續(xù)在相應(yīng)的溫度下振蕩培養(yǎng)5 d，按上述方法接種后未出現(xiàn)菌落生長的最小濃度為該菌的MBC。同理，測(cè)得香茅精油、丁香精油的MBC 和MIC。

1.2.4 3 種植物精油成分分析

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]，并進(jìn)一步優(yōu)化條件：

石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×50 m），載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。離子源溫度 230 ℃，電離電壓：70 eV；四級(jí)桿溫度：150 ℃，保持5 min；掃描模式：全掃描；掃描范圍：50 m/z～650 m/z。

丁香精油氣相色譜（gas chromatography，GC）條件：分流進(jìn)樣，分流比 100 ∶1，進(jìn)樣口溫度 250 ℃，升溫程序，初始溫度 50 ℃，以 3 ℃/min 速率升至 180 ℃，以4 ℃/min 速率升至 230 ℃，保持 1 min；牛至精油氣相色譜GC 條件：分流進(jìn)樣，分流比100 ∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序，初始溫度 60 ℃，以 10 ℃/min 速率升至 150 ℃，以 4 ℃/min 速率升至 230 ℃，保持 1 min；香茅精油氣相色譜GC 條件：分流進(jìn)樣，分流比50 ∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序，初始溫度50 ℃，保持2 min，以 5 ℃/min 速率升至 200 ℃，保持 1 min，以 10 ℃/min速率升至280 ℃，保持1 min。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)體外抑菌活性試驗(yàn)，進(jìn)行3 次平行，數(shù)據(jù)采用SPSS 22 以平均值（X）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。對(duì)采集得到的質(zhì)譜圖用美國國家科學(xué)技術(shù)研究所的NIST 質(zhì)譜庫08 版（NIST08.L）進(jìn)行匹配，根據(jù)匹配度對(duì)化合物進(jìn)行定性，用峰面積歸一化法計(jì)算樣品中各成分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈測(cè)定結(jié)果

依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》來判斷精油對(duì)藥物的敏感性[17]，其結(jié)果見表1，陰性對(duì)照未出現(xiàn)抑制效果。

從表1 可知，3 種精油對(duì)S.albus 表現(xiàn)出中度敏感；牛至、丁香精油對(duì)E.coli 表現(xiàn)出中度敏感，香茅精油無抑制作用；牛至精油對(duì)P.aeruginosa 表現(xiàn)出低度敏感，而香茅和丁香精油無抑制作用；牛至對(duì)S.aureus 表現(xiàn)出很強(qiáng)抑制作用，為最敏感，丁香次之，香茅相對(duì)較弱，但均為中度敏感；香茅、丁香、牛至精油對(duì)S.albus有較強(qiáng)的抑制作用，均表現(xiàn)出最敏感，在三者中，香茅最強(qiáng)，牛至相對(duì)較弱。

表1 3 種精油抑菌圈直徑Table 1 Diameters of bacteriostasis circles of three essential oils

2.2 MIC和MBC測(cè)定結(jié)果

按照“1.2.3”的內(nèi)容，得出3 種精油對(duì)5 種常見病原菌的MIC 和MBC，7 號(hào)陽性對(duì)照管出現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁，有菌落生長，8、9 陰性對(duì)照管培養(yǎng)液澄清，無菌落生長。結(jié)果見表2、表3。

表2 3 種精油的最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations of three essential oils

表3 3 種精油的最小殺菌濃度Table 3 Minimum bactericidal concentration of three essential oils

從表2 和表3 看出，3 種植物精油對(duì)5 種常見病原微生物有不同程度的抑制作用。對(duì)S.albus 說，香茅精油較強(qiáng)，殺滅濃度在2.375%～4.75%，牛至、丁香較弱，在4.75%～9.5%之間；牛至精油對(duì)E.coli 的殺滅較其余兩者強(qiáng)，殺滅濃度在1.188%～2.375%之間，丁香次之，香茅精油作用較弱，大于9.5%；三者對(duì)P.aeruginosa 表現(xiàn)出較弱的殺滅效果，殺滅濃度均大于9.5%；對(duì)S.aureus 殺滅效果較好的為牛至、香茅精油，殺滅濃度小于1.188%，相對(duì)較弱的為丁香精油，殺滅濃度在2.375%～4.75%之間；對(duì)C.albicans 殺滅效果最好的為丁香精油，殺滅濃度在0.297%～0.594%之間，牛至精油次之，相對(duì)較弱的為香茅精油，殺滅濃度在4.75%～9.5%之間。

2.3 3種植物精油化學(xué)成分分析

2.3.1 牛至精油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

以出峰保留時(shí)間（retention time）為橫坐標(biāo)，離子豐度（abundance）為縱坐標(biāo)建立精油化學(xué)成分總離子流圖（下同）牛至精油GC-MS 總離子流圖見圖1。

圖1 牛至精油化學(xué)成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow chart of chemical constituents of Origanum vulgare essential oil

由圖1 可知，共顯示出22 個(gè)峰，其中可分離鑒定出13 種化合物，占色譜總流出峰相對(duì)百分含量的99.48%，具體見表4。

牛至精油中含量由高到低的順序?yàn)殡p戊烯（33.93%）、百里香酚（19.12%）、4-萜品醇（14.92%）、α-蒎烯（10.87%）、樟腦萜（7.98%）、4-甲基-1-（1-甲基乙基）-環(huán)己烯（4.13%）、萜品油烯（3.62%）、丁香酚（2.04%）、萜品烯（1.93%）、β-松油醇（0.30%），占已鑒別出化學(xué)成分的99.36%。文獻(xiàn)報(bào)道[18]，其較多的烯、酚類物質(zhì)是發(fā)揮抑菌作用最強(qiáng)的活性成分，具有廣泛的研究價(jià)值。

表4 牛至精油化學(xué)成分Table 4 Chemical constituents of Origanum vulgare essential oil

2.3.2 丁香精油GC-MS 分析

丁香精油的GC-MS 化學(xué)成分總離子流圖見圖2。

共分離出15 個(gè)峰，可鑒別出12 中物質(zhì)，占色譜總流出峰相對(duì)百分含量的99.71%，具體見表5。

其中丁香酚（86.54%），1-石竹烯（10.41%），丁香精油中起主要抑菌作用的為丁香酚，丁香酚成分越高，抗菌作用越高[19]。

圖2 丁香精油化學(xué)成分總離子流圖Fig.2 Total ion flow chart of chemical constituents of clove essential oil

表5 丁香精油化學(xué)成分Table 5 Chemical constituents of clove essential oil

續(xù)表5 丁香精油化學(xué)成分Continue table 5 Chemical constituents of clove essential oil

2.3.3 香茅精油GC-MS 分析

香茅精油的GC-MS 化學(xué)成分總離子流圖見圖3。

共分離出40 個(gè)峰，通過鑒定可識(shí)別出22 種化合物，占色譜總流出峰相對(duì)百分含量的86.89%，具體見表6。

圖3 香茅精油化學(xué)成分總離子流圖Fig.3 Total ion flow chart of chemical constituents of citronella essential oil

表6 香茅精油化學(xué)成分Table 6 Chemical constituents of citronella essential oil

續(xù)表6 香茅精油化學(xué)成分Continue table 6 Chemical constituents of citronella essential oil

主要由香茅醛（31.38%）、香葉醇（18.43%）、9 種烯（16.07%）、5 種醇（27.3%）及些許烷烴、酯類組成，香茅醛、香葉醇已被證實(shí)有較強(qiáng)的抑菌效果[20]。

3 結(jié)論

3 種植物精油對(duì)5 種常見病原微生物均有一定程度的抑菌作用，與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物殺菌劑相比，天然植物精油具有廣譜抑菌效果、毒性小、利用率高的優(yōu)勢(shì)，逐漸受到越來越多研究者的關(guān)注。在“禁抗、限抗”的新時(shí)代背景下，植物精油滿足社會(huì)的需求，將植物精油用于食品，其防腐作用能有效的提高食品質(zhì)量，促進(jìn)食品安全。植物精油含有的各種生物活性成分將成為新型藥物研發(fā)不可或缺的一部分，但由于植物精油提取率相對(duì)較低，導(dǎo)致價(jià)格相對(duì)較高，并且植物精油質(zhì)量是確保精油發(fā)揮臨床療效及安全的重要基礎(chǔ)，是制約精油類制劑研發(fā)的關(guān)鍵所在。因此，植物精油類制劑的研發(fā)在我國還處于萌芽階段。在響應(yīng)社會(huì)需求的前提下，期待越來越多的精油類制劑問世，來遏制日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性及獸藥殘留，進(jìn)而促進(jìn)食品安全。