襄麥冬黃酮提取及其體外活性研究

申夢娜，陳哲，楊潤，李佳佳，石桂芳，宋凱，呂虎晉，余海忠，王海燕

（湖北文理學院食品科學技術(shù)學院·化學工程學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053）

麥冬為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，其根比一般植物的根要粗大一些，根的形狀為中間肥大而兩端細小，通常說的麥冬是指麥冬較粗的塊根部位。麥冬中含有許多活性成分，如黃酮、多糖和皂苷等，具有降低血糖[1-2]、血脂[3]水平、延緩衰老[4]、延長生命[5]、防止中性粒細胞呼吸發(fā)生暴發(fā)、保護心腦血管[6]、改善記憶障礙[7]、提高小鼠的免疫能力、抗氧化[8-9]等作用。襄麥冬即湖北麥冬，為百合科山麥冬屬植物，主要產(chǎn)地為湖北襄陽市歐廟鎮(zhèn)，是襄陽特有的品種。本課題組前期對襄麥冬多糖的提取工藝[10]及其體外抗氧化活性、襄麥冬皂苷的抑菌活性[11]、襄麥冬黃酮的抑菌（大腸桿菌和邦戈爾沙門氏菌）活性[12]進行了研究。本文采用索氏提取器提取襄麥冬黃酮，然后對其抗氧化活性，包括還原力、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH 自由基清除率進行研究，同時采用濾紙片法和二倍稀釋質(zhì)量法測量金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小和最低抑菌濃度，對襄麥冬黃酮的抑菌活性進行研究，以期為襄麥冬黃酮的保健價值及醫(yī)用價值的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

襄麥冬：采自襄陽市歐廟鎮(zhèn)；金黃色葡萄球菌：湖北文理學院食品科學技術(shù)學院·化學工程學院孫永林老師惠贈；枯草芽孢桿菌：上海魯微有限公司。

蘆丁：上海展云化工有限公司；維生素C：國藥集團化學試劑有限公司；鐵氰化鉀：洛陽市化學試劑廠；硫酸亞鐵、過氧化氫：西隴化工股份有限公司；水楊酸：天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；Tris-HCl：上海展云化工有限公司；鄰苯三酚：成都科龍化工試劑廠；DPPH：上海源葉生物有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 試驗設備

LD-Y300A 粉碎機：上海頂帥電器有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BSXT-02 索氏提取器：上海喬楓實業(yè)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；LKH-250OF 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；V-1800 型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇榮華儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 襄麥冬的預處理

將新鮮的麥冬塊根洗凈，放入烘箱里50 ℃烘干到可打粉程度，再放入粉碎機中粉碎，將襄麥冬粉過60目篩，收集過篩后的襄麥冬粉末保鮮保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 襄麥冬黃酮的提取

用分析天平準確稱取20 g 的襄麥冬粉末，用紗布將麥冬粉末包好放到索氏提取器中，利用最佳提取條件：80%的乙醇在80 ℃下、麥冬粉末與乙醇的料液比為 1 ∶20（g/mL），回流提取 5 h[13]。提取液回收乙醇，然后將乙醇麥冬黃酮混合液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮到合適濃度，收集保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 襄麥冬黃酮濃度的測定

2.3.1 襄麥冬黃酮的標準曲線

參照文獻[14]方法，以溶液的吸光度為縱坐標，蘆丁標準液質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3.2 襄麥冬黃酮濃度的測定

吸取1 mL 的襄麥冬總黃酮提取液于10 mL 容量瓶中，加入0.3 mL 的質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置6 min，加入0.3 mL 的10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置6 min，加入4 mL 的4%氫氧化鈉溶液，用去離子水定容到10 mL，混勻后靜置15 min[15]。用紫外分光光度計在510 nm 波長處測定襄麥冬總黃酮提取液的吸光值。

2.4 襄麥冬還原力的測定

2.4.1 普魯士藍法測定襄麥冬黃酮的還原力

用無水乙醇將襄麥冬總黃酮提取液和維生素C的醇溶液稀釋10 倍，用移液槍分別吸取稀釋后的待測液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 的棕色容量瓶中，加入10 mg/mL 的鐵氰化鉀溶液1.0mL，pH=6.5 的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，混勻后置于50 ℃水浴加熱20 min，加入100 mg/mL 的三氯乙酸溶液1.0 mL，混勻后靜置10 min，加入1 mg/mL 的三氯化鐵溶液1.0 mL，加入去離子水1.0 mL，用無水乙醇定容至10 mL，靜置10 min，用紫外分光光度計在波長700 nm 處測定溶液的吸光度[16]。重復測量3 次，取平均值。

2.4.2 水楊酸法測定襄麥冬黃酮對羥自由基的清除率

取6 支試管，分別編號1～6，用移液槍向6 支試管中各加入2.0 mL 2.0 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和2.0 mL 1.0 mmol/L 的過氧化氫溶液，混合均勻，各加入6.0 mmol/L 水楊酸3.0 mL，置于37 ℃水浴加熱15 min后取1 號試管溶液在510 nm 波長處測定其吸光度A0。2～6 號試管中分別加入待測樣品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，離子水 0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，混勻后 37 ℃水浴繼續(xù)加熱15 min 后分別測定溶液的吸光值Ax[17]。按照上述試驗步驟，用2.0 mL 的去離子水取代過氧化氫溶液作空白對照組試驗，測其溶液吸光度Ax0。按照以上步驟重復測量3 次，取平均值。羥自由基清除率計算公式為：

2.4.3 鄰苯三酚測超氧陰離子自由基清除率

取 5 支 10 mL 離心管別編號 1～5，加入pH＝8.2 的50 mmol/L 的Tris-HC1 緩沖液4.5 mL，以及待測樣品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，然后依次向 1～5 試管中加入去離子水 0.8、0.6、0.4、0.2 、0.0 mL，混勻，25 ℃保溫20 min，取出后立即向試管中加入在25 ℃水中溫育過的3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液0.3 mL（鄰苯三酚溶液用10 mmol/L 的HCL 溶液配制）?；旌暇鶆蚝罅⒓从梅止夤舛扔嬙诓ㄩL325 nm 處測定溶液的吸光度。取出后再次搖勻靜置4 min 后再次在波長325 nm 處測其吸光值[18]。計算4 min 內(nèi)溶液吸光值的增加值ΔAX。與此類似，以1 mL 蒸餾水取代1 mL 的待測樣品與去離子水體積，測得4 min 內(nèi)溶液吸光度的增加值ΔA0。

2.4.4 襄麥冬黃酮對DPPH 自由基的清除率的測定

取5 個10 mL 的容量瓶，用移液槍吸稀釋后的待測樣品液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于容量瓶中，用無水乙醇將樣品液稀釋至刻度線，向10 mL 的比色管中加入DPPH 溶液2 mL，然后再向比色管中加入各濃度待測樣品液2 mL，混勻后25 ℃避光靜置30 min，在波長517 nm 處用分光光度計測量溶液的吸光值Ai；用2 mL的無水乙醇代替待測樣品液與2 mL 的DPPH 溶液混合均勻靜置30 min 后，在波長517 nm 處用分光光度計測量溶液的吸光值A0；用2 mL 無水乙醇代替DPPH溶液與2 mL 的各濃度待測樣品液混合均勻靜置30 min 后，在波長517 nm 處用分光光度計測量溶液的吸光值Aj[19]。每一組吸光值按上述步驟平行測定3次，取其平均值。清除率按公式計算為：

2.4.5 含菌平板的制備

將培養(yǎng)基、1 mL 槍頭、培養(yǎng)皿、試管和生理鹽水放入高壓蒸汽滅菌鍋中，溫度設置為121 ℃，時間設定為24 min，待滅菌結(jié)束后，將所有滅菌好的物品放入烘箱中備用。然后將所用菌種用劃線法接于培養(yǎng)基中，放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。然后將已滅菌的9 支試管放入試管架中，分別將9 支試管進行編號1～9，將1 號試管中加入10 mL 的生理鹽水，其他8 支試管中加入9mL 生理鹽水，然后用接種環(huán)挑起所用菌種的一個菌落，將其加入1 號試管中，并將其設定為菌懸液的初始濃度，以1 號為起始點采用十倍系列稀釋得到 2 號～9 號菌懸液。選擇 1、2、3 號試管菌懸液制作含菌平板。

2.4.6 襄麥冬黃酮抑菌試驗

將干燥的直徑為10 mm 濾紙片分別放入不同濃度的黃酮提取液中放置2 h，取出晾干后放入超凈工作臺中，用紫外光照射10 min～15 min，貼在含菌培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量沒有長菌圓圈的直徑[12，20-21]即得抑菌圈大小。

取4 支試管分別編號為1～4，將已提取出的9.3 mg/mL 黃酮提取液采用二倍稀釋法稀釋成3.5、1.75、0.875 mg/mL 的黃酮提取液。分別向 1～4 號試管中加入濃度為 7.0、3.5、1.75、0.875 mg/mL 的黃酮提取液1 mL。吸取1 mL 的液體培養(yǎng)基于1～4 號試管中，加入1 號菌懸液0.1 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)好的1～4 號試管中吸取0.3 mL 于平板中，然后用涂布勾將加入的液體涂滿培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基表面是否有菌落生長，比較菌落數(shù)量的多少[22-24]，確定最低抑菌濃度。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8 作圖；采用SPSS16.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

3 試驗結(jié)果

3.1 黃酮提取液濃度測定結(jié)果

蘆丁標準曲線圖如圖1 所示。

圖1 蘆丁標準液的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin standard liquid

標準曲線方程為Y=12.444X-0.008 4，R2=0.999 3>0.999，證明蘆丁標準液在所測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將所測出的襄麥冬黃酮溶液的吸光值代入標準曲線方程得出襄麥冬黃酮濃度。

3.2 還原力的測定結(jié)果

襄麥冬黃酮和維生素C 的還原力測定結(jié)果如圖2所示。

由圖2 可知，通過吸光度比較還原力的大小，隨著總麥冬黃酮和維生素C 量的增加還原力逐漸增強。通過擬合曲線方程得出吸光度取值一半時，麥冬黃酮的IC50=2.038 μg/mL；維生素 C 的 IC50=1.868 1 μg/mL。得出還原力大?。壕S生素C 還原力＞麥冬黃酮還原力。

3.3 羥自由基清除率測定結(jié)果

襄麥冬黃酮和維生素C 對羥自由基的清除作用如圖3 所示。

圖2 襄麥冬黃酮和維生素C 的還原力Fig.2 The reduction force of flavonoids and vitamin C in the case

圖3 襄麥冬黃酮和維生素C 對羥自由基清除率Fig.3 The hydroxyl radical clearance rate of the flavonoids and vitamin C

由圖3 可知，隨著總麥冬黃酮和維生素C 量的增加，羥自由基清除率逐漸增強。通過擬合曲線方程得出麥冬黃酮的IC50=1.709 7 μg/mL；維生素C 的IC50=147.589 9 μg/mL。得出羥自由基清除率大?。合妍湺S酮羥自由基清除率＞維生素C 羥自由基清除率。

3.4 超氧陰離子自由基清除率測定結(jié)果

襄麥冬黃酮和維生素C 對超氧陰離子自由基的清除作用如圖4 所示。

圖4 襄麥冬黃酮和維生素C 對超氧陰離子自由基清除率Fig.4 The removal rate of superoxide anion free radical by flavonoids and vitamin C

由圖4 可知，隨著總麥冬黃酮和維生素C 量的增加，超氧陰離子自由基清除率逐漸增強。通過擬合曲線方程得出麥冬黃酮的IC50=71.375 μg/mL；維生素C的IC50=23.415 μg/mL。得出清除率大小：維生素C 超氧陰離子自由基清除率＞襄麥冬黃酮超氧陰離子自由基清除率。

3.5 DPPH自由基清除率測定結(jié)果

襄麥冬黃酮和維生素C 對DPPH 自由基的清除作用如圖5 所示。

圖5 襄麥冬黃酮和維生素C 對DPPH 自由基清除率Fig.5 The DPPH free radical clearance rate of the flavonoids and vitamin C

由圖5 可知，隨著襄麥冬黃酮和維生素C 量的增加，DPPH 自由基清除率逐漸增強。通過擬合曲線方程得出麥冬黃酮的IC50=5.801 9 μg/mL；維生素C 的IC50=19.913 4 μg/mL。得出DPPH 自由基清除率大小：襄麥冬黃酮對DPPH 自由基清除率＞維生素C 對DPPH 自由基清除率。

3.6 襄麥冬黃酮抑菌圈大小測定

索氏提取的黃酮提取液初始濃度為7.0 mg/mL，將7.0 mg/mL 的黃酮提取液稀釋成濃度為 6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mg/mL 的黃酮提取液，采用濾紙片法得到的結(jié)果見表1（抑菌直徑不明顯的未顯示）。

表1 襄麥冬黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of flavonoid from Liriope spicata on staphylococcus aureus

根據(jù)表1 可知，當襄麥冬黃酮提取物在7.0 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑制作用很顯著，最大抑菌直徑可達18.80 mm，隨著襄麥冬黃酮提取物的濃度增加，抑菌活性也隨之增強。

將濃度為4.0 mg/mL 的黃酮提取液進行梯度稀釋得到不同濃度的黃酮溶液，采用濾紙片法得到的結(jié)果見表2。

表2 襄麥冬黃酮對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of flavonoid from Liriope spicata on bacillus subtilis

根據(jù)表2 可知，當襄麥冬黃酮提取物在4.0 mg/mL和3.0 mg/mL 時，對枯草芽孢桿菌的抑制作用很顯著，最大抑菌直徑可達16.30 mm，隨著襄麥冬黃酮提取物的濃度增加，抑菌活性也隨之增強。

3.7 襄麥冬黃酮最低抑菌濃度

在對黃酮提取物的最小抑菌濃度測定是根據(jù)將已接好的細菌放入藥液中培養(yǎng)24 h 后，接于平板中培養(yǎng)24 后觀察細菌在平板中的生長狀況，結(jié)果見表3。

表3 襄麥冬黃酮的最低抑菌濃度Table 3 The minimum inhibitory concentration of flavonoid from Liriope spicata

由表3 可知，金黃色葡萄球菌在 3.5、1.75、0.875 mg/mL 時，平板中都存在菌落，并且在1.75、0.875 mg/mL 時菌落數(shù)較多。但是在7.0 mg/mL 時，平板中無菌落出現(xiàn)。由此可知黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為7.0 mg/mL。同時枯草芽孢桿菌在 3.5、1.75、0.875 mg/mL 時，平板中都存在菌落，并且在1.75、0.875 mg/mL 時菌落數(shù)較多。但是在7.0 mg/mL時，平板中無菌落出現(xiàn)。由此可知黃酮提取物對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為7.0 mg/mL。

4 結(jié)論

本試驗通過索氏回流提取法來提取襄麥冬總黃酮，通過與相同濃度的維生素C 溶液的抗氧化性做對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)維生素C 的還原力比襄麥冬總黃酮的強，而襄麥冬總黃酮對羥自由基的清除效果比維生素C 強，當濃度為119.63 μg/mL 時，襄麥冬總黃酮對羥自由基的清除率可高達96.10%，表現(xiàn)出優(yōu)良的羥自由基清除性能。維生素C 對超氧陰離子自由基的清除能力大于襄麥冬總黃酮，在濃度為33 μg/mL～165 μg/mL 范圍內(nèi)，維生素C 和總黃酮提取液的還原力都隨著濃度的增加而增加。襄麥冬總黃酮對DPPH 自由基的清除能力比維生素C 強，當濃度為47.85 μg/mL時，襄麥冬總黃酮對DPPH 自由基的清除率可高達95.39%。在抑菌活性研究中發(fā)現(xiàn)，襄麥冬黃酮對枯草芽孢桿菌的抑菌作用比金黃色葡萄球菌敏感，而對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度均為7 mg/mL。綜上所述，襄麥冬黃酮具有一定的抗氧化活性以及抑菌活性，可為襄麥冬活性成分進一步開發(fā)利用提供重要參考。