醬香型白酒中非乙醇類物質抗炎活性研究

曹會，劉杰，劉志剛

（深圳大學 過敏反應與免疫學研究所，廣東深圳518055）

白酒是以糧食、谷物為主要原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾等工序制得的蒸餾酒[1]，而醬香型白酒是深受消費者喜愛的獨特香型之一。研究顯示，醬香型白酒中含有多種風味物質，如酯類、醇類、酸類、醛類、酮類以及酚類等[2-3]。部分風味化合物具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[4-5]。NO 是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，調節(jié)NO 的生成及一氧化氮合酶（iNOS）的表達被認為是治療炎性疾病的重要手段[6]。IL-6、IL-8 是重要的促炎細胞因子，異常釋放會導致機體多器官細胞代謝障礙和功能損害[7]，而IL-10 是重要的抗炎細胞因子[8]。研究顯示，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻擊約 30 min 后即可見促炎細胞因子（IL-6、IL-8）的大量釋放，而IL-10 則在 LPS攻擊后6 h～8 h 達到高峰，較促炎細胞因子反應延遲[9]。腫瘤壞死因子（TNF-α），又稱前炎癥細胞因子，是啟動炎癥反應的關鍵細胞因子[10]。

緊密連接蛋白Occludin 和ZO-l 是構成腸道上皮連接復合體多蛋白復合物的主要結構蛋白[11]。研究表明，腸道上皮緊密連接的完整性受損及腸道滲透性增加與許多胃腸道疾病的發(fā)病機制相關。腸道上皮細胞在受到刺激或發(fā)生炎癥時，其緊密連接完整性會出現(xiàn)一定的損傷，進而導致腸黏膜屏障功能下降，最終會使腸道細菌或其它異物進入循環(huán)系統(tǒng)[12]。

醬香型白酒是經(jīng)高粱等多種糧食作物經(jīng)過發(fā)酵等多種工序獲得的純天然性酒精飲品，不論是傳統(tǒng)中醫(yī)中藥研究還是現(xiàn)代藥理學研究，結果均顯示其具有廣泛的藥理作用，而白酒在抗炎及對腸道疾病方面的藥效也具有較多的報道。但由于酒精的存在及白酒中其它有效成分的含量甚微，加之提取分離純化等技術條件的制約，使得人們對白酒中非乙醇成分的研究較少。本研究通過氯仿萃取及冷凍干燥的方式獲得醬香型白酒中的非乙醇活性物質，并通過液相色譜-質譜聯(lián)用技術（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析其化合物組成，建立LPS誘導的IEC-6 細胞炎癥模型，探討醬香型白酒中非乙醇物質（maotai-flavor liquor extract，MTE）對模型細胞及細胞緊密連接蛋白的作用。從而為闡明MTE 對LPS誘導的IEC-6 的細胞增殖、炎性反應及細胞間緊密連接蛋白等的作用及機制提供一定的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠小腸隱窩上皮IEC-6 細胞株：美國ATCC 公司；醬香型白酒：貴州茅臺集團；LPS：Sigma 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青鏈霉素：HyClone 公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：廣州瑞舒生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基：HyClone 公司；0.25%胰蛋白酶（≥180 U/mg）：Gibco 公司；IL-6、IL-8、TNF-α、NO、IL-10 試劑盒：碧云天生物科技有限公司；ExScript TM RT-PCR Kit 試劑盒：TaKaRa 公司。

1.2 主要儀器

api 3000 液質聯(lián)用儀 HPLC-MS/MS：ABSCIEX 公司；FORMA 3111 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：賽默飛公司；1510 多功能酶標儀：賽默飛公司；CFX96PCR 儀：Bio-Rad 公司；RE-2000B 旋轉蒸發(fā)儀：瑞德儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 MTE 的分離及 HPLC-MS 分析

500 mL 分液漏斗中加入100 mL 醬香型白酒、40 mL水和150 mL 氯仿，震蕩搖勻，靜置，分離氯仿層，重復3 次，合并氯仿層。用旋轉蒸發(fā)儀（0 ℃）除去氯仿獲得有機層化合物。真空凍干機凍干水層，獲得水層化合物，合并有機層及水層化合物為MTE，-20 ℃避光保存。HPLC-MS 分析方法參考文獻進行[13]。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)于含有10 %的FBS、105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、90%相對濕度的培養(yǎng)箱內，隔天換液。

細胞濃度2×105/mL 加入含有0.10 mg/mL 的化合物的96 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，加入1.0 mg/L LPS培養(yǎng)4 h，CCK8 檢測細胞增殖能力。

細胞濃度2×105/mL 加入含有0.20 mg/mL 的白酒（53 度）、MTE、α-雪松醇、乙醇 ∶水（體積比 53 ∶47）的96 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，加入1.0 mg/L LPS 培養(yǎng)4 h，CCK8 檢測化合物對增殖能力及流式檢測細胞凋亡的情況。

細胞濃度2×105/mL 加入含有0.20 mg/mL 的白酒（53 度）、MTE、α-雪松醇、乙醇/水（體積比為 53 ∶47）的96 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，加入1.0 mg/L LPS 培養(yǎng)4 h，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測定 NO、TNF-α 等相關炎癥因子濃度。細胞裂解后收集裂解物，提取RNA，采用定量PCR 測定TNF-α、IL-10 等基因的相對表達。

1.3.3 RNA 提取和 cDNA 的合成

培養(yǎng)細胞吸去培養(yǎng)基，加入0.50 mL 細胞裂解液，收集于2.0 mL 離心管，室溫25 ℃靜置2 min 后加入0.10 mL 氯仿，劇烈振蕩 15 s 混勻，靜置 2 min～3 min。在4 ℃1.2×104g 離心3 min，取上層水相加入等量異丙醇，漩渦振蕩，室溫 25 ℃放置 10 min；1.2 × 104g 離心10 min，棄上清，沉淀中加入1.0 mL 75%乙醇洗滌，室溫25 ℃干燥后加入30 μL 的DEPC 水溶解即得總RNA，其 OD260/280為 1.8～2.0[14]。cDNA 的合成使用SYBR@PrimeScriptTMRT-PCR Kit，按試劑盒操作說明進行。

1.4 PCR擴增

IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10、Occludin、ZO-1 和 βactin cDNA 參照 GenBank 中公布的序列，利用Primer5.0 軟件設計引物，并合成。試驗實時熒光定量PCR 采用SYBR Green I 染料法，按照ExScriptTMRTPCR Kit 試劑盒操作說明書在定量PCR 儀進行?？偡磻w積 10.0 μL 體系：SYBR-Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，引物（10 μmol/L）2.0 μL，cDNA 模版 1.0 μL，雙蒸水2.0 μL。PCR 反應條件：預變性 95 ℃ 10 s，變性 95 ℃5 s，熒光檢測 72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18 軟件進行統(tǒng)計。對陰性對照和陽性對照采用獨立樣本t 檢驗，對MTE 處理效應進行回歸分析。p ＜0.05 定為具有顯著性差異，結果均以 Mean±SEM 表示。

2 結果與分析

2.1 MTE的分離提取及化合物分析

MTE 中相關化合物對IEC-6 細胞增殖能力的影響見表1。

本試驗中100 mL 白酒經(jīng)萃取及冷凍干燥，最終獲得 MTE 0.75 mg。HPLC-MS 分析，MTE 多為多元醇、不飽和脂肪酸及其酯類化合物、吡嗪類化合物及含有苯環(huán)的芳香族化合物，選出其中26 個化合物及MTE 進行體外抗炎活性研究。

2.2 MTE對IEC-6細胞增殖能力的影響

腸上皮細胞是腸黏膜機械屏障的主要組成部分，可分泌細胞因子和趨化因子，在腸道免疫系統(tǒng)中起重要作用，該細胞受損將會增加腸道黏膜的滲透性，從而增加腸道LPS 的遷移[15]。0.10 mg/mL MTE 化合物預處理細胞24 h 后，加入1.0 mg/L LPS 培養(yǎng)4 h，CCK8檢測細胞增殖能力。相比于正常（細胞增殖能力設為100%）組，LPS 組細胞增殖能力顯著下降（83.3%，p＜0.05）。分析試驗結果發(fā)現(xiàn)，部分化合物可顯著的降低由LPS 誘導引起的細胞增殖能力降低。與LPS 組相比，MTE-2、3、5 及 11 與 IEC-6 細胞共培養(yǎng) 24 h 后，與LPS 組相比，細胞增殖能力分別提高13.2%，11.9%，10.3%及11.5%。不同于MTE-2 等的保護作用，MTE-18、20、21 共培養(yǎng)降低了細胞增殖能力，與LPS 組相比，細胞增殖能力分別降低9.5%，8.5%及8.3%。因此，選擇MTE-2 繼續(xù)進行抗炎活性研究。

2.3 MTE對IEC-6細胞相關炎癥因子表達影響

MTE 對 IEC-6 細胞分泌 NO、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10 的影響見表2。

表2 MTE 對 IEC-6 細胞分泌 NO、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10 的影響Table 2 Effects of MTE on NO，IL-6，IL-8，TNF-alpha and IL-10 secretion by IEC-6 cells

分析表2 試驗結果可知，LPS 刺激使 NO、IL-6、IL-8、TNF-α 分泌顯著升高（p＜0.05），降低了 IL-10 的分泌。在 MTE、α-雪松醇處理后，TNF-α、NO 及 IL-6的分泌量顯著降低，而IL-10 分泌量則顯著增加，對IL-8 分泌量影響不明顯。不同于MTE、α-雪松醇，白酒及乙醇組未表現(xiàn)出對IEC-6 的保護作用，相關炎性因子TNF-α、NO 及IL-6 的分泌量不但沒有降低，相比于LPS 組，其分泌量反而增加。推測是乙醇具有一定的致炎作用導致的。但同樣是53%的酒精濃度，醬香型白酒對細胞的損傷弱于酒精，推測是白酒中的其它物質減弱了乙醇對細胞的損傷作用。

2.4 MTE對IEC-6細胞凋亡、細胞遷移能力的影響

MTE 對LPS 誘導的IEC-6 細胞凋亡及細胞遷移能力的影響見圖1。

圖1 MTE 對LPS 誘導的IEC-6 細胞凋亡及細胞遷移能力的影響Fig.1 Effects of MTE on LPS-induced IEC-6 cell apoptosis and cell migration

圖1-A 結果顯示，LPS 刺激IEC-6 細胞后，細胞凋亡率明顯增加（正常組，p＜0.05）。MTE、α-雪松醇組IEC-6 細胞凋亡率明顯降低。與LPS 組比較，MTE、α-雪松醇處理后細胞凋亡率下降8.49%、13.2%。不同于MTE、α-雪松醇的保護作用，白酒組、乙醇組細胞凋亡率與正常組組比較，分別上升17.7%、22.4%。說明白酒、乙醇加重了LPS 對細胞的損傷，使細胞凋亡率上升。

同時試驗采用細胞劃痕試驗檢測MTE 對LPS 誘導的IEC-6 細胞遷移能力的影響，為便于比較，將正常組細胞遷移能力設為100%，其它組為相對值。結果如圖1-B 所示：與正常組比較，LPS 刺激ICE-6 細胞后，細胞遷移率顯著降低（與正常組比較，p＜0.05）。用MTE、α-雪松醇處理后，細胞遷移率顯著提高（與LPS組比較，p＜0.05），提示 MTE、α-雪松醇可增強 IEC-6細胞抗LPS 損傷的能力。而白酒、乙醇組，細胞遷移能力與LPS 組相比，均有下降，推測可能是乙醇與LPS協(xié)同使IEC-6 細胞凋亡率上升、細胞遷移能力下降。

2.5 MTE對IEC-6細胞炎性細胞因子基因表達的影響

MTE 對IEC-6 細胞炎性細胞因子基因表達的影響見圖2。

圖2 MTE 對 LPS 處理 IEC-6 細胞 iNOS、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、Occludin 及 ZO-1 mRNA 表達的影響Fig.2 Effects of MTE on the expression of iNOS，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-alpha，Occludin and ZO-1 in IEC-6 cells treated with LPS

如圖2 所示用LPS 刺激IEC-6 細胞后，與正常組相比，iNOS、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 表達明顯上升（p＜0.05），而 IL-10 mRNA 表達下降。ZO-1、Occludin mRNA 表達明顯下降，與對照組相比（p＜0.01）。MTE、α-雪松醇處理后，其mRNA 表達明顯提高（與LPS 比較，p＜0.05）。該試驗結果說明，LPS 可導致 IEC-6 細胞相關炎性因子mRNA 的表達上升，Occludin 和ZO-1 mRNA 的表達下調，而MTE、α-雪松醇可抑制LPS 所致的ZO-1 mRNA 表達下調及炎性因子mRNA 的表達上升，使之恢復至接近正常水平。

3 結論

本研究采用LPS 刺激IEC-6 細胞建立細胞炎癥模型探究醬香型白酒中非乙醇類物質抗炎活性。結果顯示，MTE-2（α-雪松醇）可顯著抑制LPS 誘導的IL-6、TNF-α 等炎性因子分泌，增強細胞遷移能力，說明MTE-2 可有效的抑制LPS 誘導的炎癥反應，增強細胞損傷修復能力。

LPS 刺激 IEC-6 細胞后，Occludin 和 ZO-1 的mRNA 表達量顯著下降，用MTE-2 干預后，Occludin和ZO-1 mRNA 表達得到明顯恢復，表明腸道炎癥與緊密連接蛋白存在密切的關系。結合前面所得的試驗結果，推測MTE-2 通過增強細胞緊密連接蛋白的完整性和腸上皮屏障功能抑制LPS 所致的腸道損傷，而其中的作用機制可能與上調Occludin 和ZO-1 mRNA 與蛋白的表達密切相關。試驗結果顯示，醬香型白酒提取物表現(xiàn)出與其組分MTE-2 類似的作用，而白酒及乙醇則與LPS 發(fā)揮協(xié)同作用，并對腸道細胞緊密連接完整性和腸上皮屏障功能具有一定的損傷作用。