病原真菌的檢測技術(shù)進(jìn)展

王月華，胡珊，楊英

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；3.徐州市腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 徐州 221005

真菌在自然界中廣泛存在，也是人體皮膚、黏膜定殖的常見菌。與其他常見病原微生物如細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體不同，真菌是真核生物，有完整的細(xì)胞核、核膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁[1]。當(dāng)人體的免疫系統(tǒng)受損時，真菌會侵犯皮下組織、內(nèi)臟，進(jìn)入血液、腦脊液，引起侵襲性真菌感染或稱為深部真菌病，主要包括念珠菌、隱球菌、曲霉、毛霉、青霉、馬爾尼菲籃狀菌、孢子絲菌等。

近20 年，由于廣譜抗生素大量使用、激素和免疫抑制劑的應(yīng)用，以及侵入性治療的增加，侵襲性真菌感染的發(fā)病率不斷上升[2-3]。許多疾病如艾滋病、糖尿病、腫瘤等都合并有真菌感染，2019 年底由新型冠狀病毒SARS-CoV-2 引發(fā)的COVID-19 肺炎患者中也發(fā)現(xiàn)伴隨真菌感染[4]。據(jù)美國CDC 數(shù)據(jù)顯示，近年來出現(xiàn)的多重耐藥的耳念珠菌感染患者的死亡率為30%～60%[5]。真菌感染的早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確鑒定對于臨床真菌治療以及流行病學(xué)研究意義重大。與其他微生物相比，真菌的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，擁有堅固的細(xì)胞壁，而且真菌感染無特異性臨床表現(xiàn)，極易導(dǎo)致漏診誤診，因此真菌檢測技術(shù)的研發(fā)及轉(zhuǎn)化應(yīng)用十分重要。本文旨在探討真菌感染相關(guān)檢測技術(shù)及其存在的優(yōu)勢和不足，包括表型鑒定技術(shù)、血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)技術(shù)、光譜技術(shù)等，并對真菌檢測新技術(shù)的未來進(jìn)行了展望。

1 表型鑒定技術(shù)

臨床真菌的表型鑒定技術(shù)主要包括培養(yǎng)法和涂片鏡檢法，通過觀察真菌的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是公認(rèn)的病原體檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”，對培養(yǎng)條件進(jìn)行改進(jìn)能提高病原體檢出的陽性率，例如采用不同的溫度、pH 值、鹽濃度、培養(yǎng)基成分等[6]。另外還有一些真菌顯色培養(yǎng)基，可以通過培養(yǎng)物的顏色判別不同種的念珠菌。但是仍存在培養(yǎng)周期長、檢出率低、假陰性等問題，并不適用于真菌快速檢測。

涂片鏡檢法相比培養(yǎng)法更加快速簡單，但受主觀因素影響較大，對于操作人員也有一定的要求[7]，容易漏檢而且不易判斷菌種。常用的方法為生理鹽水法和KOH 法，此外染色涂片鏡檢中蘇木素-伊紅（HE）染色、乳酸酚棉蘭染色、嗜銀（GMS）染色、過碘酸-希夫（PAS）染色均可用于多種致病真菌，熒光染色（CFW）法相比其他鏡檢方法觀察時形態(tài)結(jié)構(gòu)更加清晰，但成本較高[8-10]。墨汁染色法用于檢查分泌物涂片或腦脊液中的隱球菌，但與其他染色方法不同，該方法屬于負(fù)染色法，并未將真菌著色，不適合用于黏稠的呼吸道分泌物[11]。近年來鏡檢技術(shù)有新的發(fā)展，Liu[12]等研究發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)合人工智能技術(shù)（AI）處理顯微圖像，可以用于疾病診斷。

2 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測主要包括抗原檢測和抗體檢測兩大類[13-14]?？乖瓩z測最常用的是G 實(shí)驗(yàn)和GM實(shí)驗(yàn)以及隱球菌抗原和念珠菌抗原檢測，抗體檢測主要包括曲霉及念珠菌的抗體檢測。

2.1 抗原檢測

2.1.1 G 試驗(yàn) G 試驗(yàn)檢測靶標(biāo)為真菌細(xì)胞壁上的（1，3）-β-D 葡聚糖，其他微生物、動物和人體中不存在此特異性抗原，當(dāng)受到真菌感染時可以通過檢測血液中的（1，3）-β-D 葡聚糖來判定。該方法操作簡單，能夠檢測出多種真菌，如念珠菌、曲霉、鐮刀菌、毛孢子菌等[15]。但是G 試驗(yàn)也存在其缺點(diǎn)，例如無法檢測隱球菌、毛霉菌、根霉菌等，在一些特殊患者檢測過程中存在假陽性結(jié)果，還會與革蘭陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁發(fā)生交叉反應(yīng)等[16]。

2.1.2 GM 試驗(yàn) GM 試驗(yàn)檢測靶標(biāo)為真菌細(xì)胞壁上的半乳甘露聚糖，也是真菌的一類特異性抗原成分，可以通過半乳甘露聚糖的釋放量來反應(yīng)感染的程度，目前主要用于侵襲性曲霉病的早期診斷[17]。乳膠凝集法（LA）、放射免疫分析法（RIA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是GM 試驗(yàn)常用的方法。GM 試驗(yàn)檢測速度快且操作簡單，還可用于監(jiān)測抗真菌治療的療效。但其仍然存在一定的局限性，首先其特異性和靈敏度較低，其次由于抗真菌治療會導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁釋放的半乳甘露聚糖更少，故GM 試驗(yàn)對于經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療的患者靈敏度和準(zhǔn)確率可能會降低[18]。

2.1.3 隱球菌抗原及念珠菌抗原檢測 新生隱球菌和格特隱球菌分泌一種莢膜多糖抗原（CrAg），可通過乳膠凝集法在血液或腦脊液中檢測[1]。念珠菌細(xì)胞壁中包含甘露聚糖，可用于檢測侵襲性念珠菌，但由于該抗原易被快速清除，所以有必要重復(fù)采樣并不斷優(yōu)化檢測技術(shù)[7]。

2.2 抗體檢測

采用靶向真菌的特異性抗體進(jìn)行檢測，常用方法包括酶聯(lián)免疫吸附法、補(bǔ)體結(jié)合法及免疫擴(kuò)散法，主要用于慢性壞死性肺曲霉病、念珠菌感染[11]等。目前已有多種真菌抗體檢測試劑盒[10]，如曲霉抗體檢測試劑盒和念珠菌抗體檢測試劑盒。曲霉IgG 類抗體是機(jī)體應(yīng)對侵襲性曲霉菌感染產(chǎn)生的非保護(hù)性抗體，通過檢測這種抗體可用于輔助診斷。但是抗體檢測也有一些缺點(diǎn)，當(dāng)患者免疫力低下時無法檢測出抗體，還會與抗原產(chǎn)生交叉感染，并且對于侵襲性曲霉病、念珠菌病和隱球菌病的效果不如抗原檢測效果好[19-21]。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

真菌感染的快速診斷對于臨床治療十分重要，然而傳統(tǒng)方法卻不斷顯現(xiàn)局限性，無論是培養(yǎng)法、涂片鏡檢法還是血清學(xué)檢測，都很難實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的菌種鑒定以及定量檢測。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)了越來越多的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，包括PCR 檢測、SNP 標(biāo)記、核酸雜交、等溫擴(kuò)增、測序、質(zhì)譜等。但是與其他微生物病原體相比，真菌病原體樣本采集位置多樣，且真菌有堅硬的細(xì)胞壁，在樣本的前期處理過程中需要有效的破壁手段，因此分子檢測相比其他微生物有一定難度。

3.1 基于PCR的技術(shù)

采用真菌的高度保守區(qū)域設(shè)計通用引物，通過PCR 擴(kuò)增目的片段進(jìn)行物種判定[22-23]?？梢赃x擇的靶基因包括 18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA 及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、基因內(nèi)間隔區(qū)（IGS）、蛋白質(zhì)編碼區(qū)和一些管家基因[24]，最常用的為ITS 序列和28S rDNA 的D1-D2 區(qū)域。PCR產(chǎn)物還可通過測序進(jìn)一步分析變異位點(diǎn)并進(jìn)行溯源。PCR 檢測速度快，靈敏度和特異性均很高，可用于多種真菌的鑒定。但須注意的是，相比其他微生物病原體，對真菌應(yīng)采取有效的破壁技術(shù)提高核酸提取效率。此外，PCR 操作過程中需要注意樣品的污染問題[25]。基于PCR 的技術(shù)包括實(shí)時熒光定量PCR、多重PCR、PCR-RFLP 等。

3.1.1 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR） 加入熒光探針或嵌入染料對PCR 反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，分析相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對所測樣本進(jìn)行判定[26]。與常規(guī)PCR 相比，熒光定量PCR 在封閉體系中進(jìn)行，后處理步驟較少，可以顯著提高靈敏度且能夠?qū)崿F(xiàn)量化，目前已有用于檢測念珠菌感染的qPCR 試劑盒，但試劑及儀器價格還較昂貴[27]。

3.1.2 多重PCR 利用不同的特異性引物同時擴(kuò)增不同的DNA 片段，可用于多種病原微生物的同時檢測，與傳統(tǒng)PCR 相比更加高效快速且經(jīng)濟(jì)簡便[26-28]。Schauwvlieghe[29]等已經(jīng)證明多重定量PCR可用于檢測曲霉菌，并發(fā)現(xiàn)曲霉菌中的cyp51A 位點(diǎn)突變。此方法需要很好地設(shè)計多對引物，保證相互沒有干擾，并篩選出合適的PCR 體系適應(yīng)于所擴(kuò)增的多個序列。

3.1.3 PCR-RFLP 將PCR 和限制性酶切結(jié)合，PCR 擴(kuò)增目的片段后，擴(kuò)增產(chǎn)物再用限制酶切割成不同大小的片段，最后通過凝膠電泳觀察所得特定片段用于鑒定真菌。PCR-RFLP 可用于分析從純培養(yǎng)物和臨床樣品中獲得的DNA，并可檢測多種致病真菌如念珠菌、毛霉菌和曲霉菌等[27]。但是由于PCR-RFLP 包含多個步驟，包括電泳分離和限制酶消化，因此存在污染的風(fēng)險且操作時間長。此外，RFLP 分析需要大量的數(shù)據(jù)庫，這會影響其在臨床中的常規(guī)使用。有一種類似的方法為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）[30-31]，顛倒了PCR 和限制性內(nèi)切酶切割的順序，該技術(shù)已被廣泛用于評估種內(nèi)變異并鑒定不同的真菌，例如臨床分離的念珠菌等。目前在流行病學(xué)研究中主要用于評估物種內(nèi)的遺傳變異，可用于分離株的基因分型。

3.2 單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）

SNP 是指由單個堿基的改變引起的核苷酸變異而形成的DNA 序列多態(tài)性，SNP 的檢測具有很高的臨床價值[32]，可通過 PCR、DNA 測序、MALDITOF-MS 等進(jìn)行檢測。基于PCR 的方法檢測特異性高，可以根據(jù)SNP 位點(diǎn)設(shè)計特異性引物，或設(shè)計能夠區(qū)分變異擴(kuò)增片段的特異性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化切割（PCR-RFLP）。DNA 測序是最容易實(shí)施的SNP 檢測方法，通過序列比較研究基因堿基的變化，可以得到SNP 的位置及類型。MALDITOF-MS 通過檢測PCR 產(chǎn)物的精確分子量并與數(shù)據(jù)庫對比，通過分子量差異來確定SNP 類型。Oliveira[33]等用SNP 標(biāo)記檢測臨床標(biāo)本中提取的煙曲霉DNA。

3.3 核酸雜交技術(shù)

采用核酸探針檢測DNA 或RNA 的特定基因序列，包括印記雜交技術(shù)（Southern 雜交、Northern雜交）、熒光原位雜交、基因芯片技術(shù)等[34]。印跡雜交技術(shù)利用硝酸纖維素膜或尼龍膜吸附DNA或RNA 進(jìn)行雜交，是核酸雜交技術(shù)中較傳統(tǒng)的方法，存在操作繁瑣、效率低、檢測序列少、自動化程度低的缺點(diǎn)。熒光原位雜交（FISH）是一項(xiàng)基于熒光探針的技術(shù)，可與微生物DNA 特定區(qū)域雜交，通過流式細(xì)胞儀（FC）或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測，在FISH 的基礎(chǔ)上還發(fā)展了肽核酸（PNA）FISH，該技術(shù)使用不帶電荷的肽核酸作探針，擁有極好的生物穩(wěn)定性，能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的結(jié)合力和更有效的反應(yīng)，速度快，已經(jīng)用于檢測念珠菌[35]?；诜肿拥牡任换蛱禺愋蕴结樇夹g(shù)也已經(jīng)廣泛用于病原體檢測和耐藥性評估，如分子信標(biāo)和小的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA 寡核苷酸[36]?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，其靈敏度和特異性受探針設(shè)計的影響，決定探針優(yōu)劣的主要因素是其長度和位置，要盡量避免非特異性雜交[37-38]。

3.4 等溫擴(kuò)增技術(shù)

等溫擴(kuò)增技術(shù)不需要溫度循環(huán)或熱穩(wěn)定的聚合酶，因此它不依賴復(fù)雜的儀器且操作時間短，可以大大降低儀器成本并具有便攜性。主要方法有滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）和核酸依賴性擴(kuò)增（NASBA）[35]。RCA 是基于滾動循環(huán)復(fù)制的技術(shù)，它通過引物和環(huán)狀DNA 模板合成，通常與圓形（掛鎖）探針（RCA-掛鎖探針）一起使用，以提高特異性和敏感性。RCA 反應(yīng)快速且抗污染，目前可用于檢測毛霉菌和隱球菌的基因型[27]。LAMP 主要通過DNA 聚合酶以及2 段特異性引物來進(jìn)行擴(kuò)增，在等溫條件（約 63℃）下 30～60 min 就可以完成核酸擴(kuò)增，操作簡單，成本低，敏感性高，結(jié)果可以采用檢測熒光強(qiáng)度和濁度進(jìn)行鑒定[39-40]。LAMP 已被用于檢測病原真菌，如白念珠菌和巴西副球菌等[27]，低成本、高特異性和快捷使其成為檢測臨床樣品真菌感染最具前景的技術(shù)之一。NASBA 是一種在恒定溫度下連續(xù)擴(kuò)增RNA 的技術(shù)，具有實(shí)時檢測功能的NASBA 已用于細(xì)菌和病毒，已經(jīng)有研究對其進(jìn)行了測試，認(rèn)為可以用于檢測念珠菌[41]。

3.5 DNA測序技術(shù)

基于序列分析的真菌鑒定可以說是真菌分子鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，公共數(shù)據(jù)庫（如GenBank）中有大量真菌序列信息，測序比對成為極強(qiáng)大的診斷工具[27]。靶序列通常為ITS 區(qū)域和28S rDNA 的D1-D2 區(qū) 域，Sidiq[42]等 研究 證明 PCR 分析 和測 序分析在真菌臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用有助于快速診斷和分析培養(yǎng)結(jié)果中的假陰性現(xiàn)象。DNA 測序技術(shù)中的宏基因組測序技術(shù)，可將環(huán)境中所有的DNA 作為研究對象，不必進(jìn)行復(fù)雜耗時的分離培養(yǎng)，主要利用二代測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析檢測環(huán)境中所有基因的總和[43]。目前DNA 測序已得到廣泛使用，但由于測序儀和分析系統(tǒng)需要較多的資金投入和專業(yè)知識，DNA 測序診斷尚未廣泛商業(yè)化。

3.6 質(zhì)譜法

3.6.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS） MALDI-TOF-MS 是將樣本的質(zhì)譜峰與數(shù)據(jù)庫中參考質(zhì)譜的特征峰進(jìn)行比較來檢測，不僅可用于蛋白質(zhì)、寡核苷酸和單基因核苷酸多態(tài)性的高通量分析，還可以直接鑒定真菌蛋白和耐藥菌株[44]。MALDI-TOF-MS 已經(jīng)在鑒定曲霉菌、念珠菌、隱球菌、雙相真菌以及一些皮膚癬菌中取得成功[45]，多項(xiàng)研究也表明其是鑒定許多不同酵母以及重要絲狀真菌的最準(zhǔn)確、快速的工具之一。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，MALDI-TOF-MS能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果，并且適合于高通量鑒定，還可用于追蹤菌株的地理起源。缺點(diǎn)是儀器昂貴，并需要分離培養(yǎng)出菌株再進(jìn)行測定，由于數(shù)據(jù)庫中缺少某些菌株的參考質(zhì)譜還易導(dǎo)致誤診，因此并沒有在臨床診斷中廣泛使用[46]。

3.6.2 PCR/ESI-MS 電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）通常與PCR 結(jié)合用于真菌檢測。PCR 檢測技術(shù)的靈敏度和特異性很高，但一次檢測覆蓋物種范圍有限，當(dāng)與ESI-MS 結(jié)合時，可用于廣泛鑒定且同時保持PCR 的靈敏度[47]。主要通過設(shè)計多對引物來覆蓋一組生物進(jìn)行檢測，PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)入質(zhì)譜儀，獲得不同產(chǎn)物的分子質(zhì)量，可確定每個擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成，并將其與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以確定菌種。Wang[48]等采用商用儀器PLEX-IDTM 系統(tǒng)進(jìn)行了研究，其中PCR 擴(kuò)增試劑盒包含16 對引物和5 個分子靶標(biāo)，PLEX-ID 通用生物傳感器平臺將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行自動脫鹽、信號收集、頻譜分析和數(shù)據(jù)報告生成。該檢測技術(shù)用于鑒定酵母和霉菌，有高精度、特異性和靈敏度的特點(diǎn)。但同樣存在質(zhì)譜儀器昂貴和數(shù)據(jù)庫不足的問題，須進(jìn)一步優(yōu)化以適用于臨床[49]。

4 光譜法

真菌光譜檢測技術(shù)主要為紅外吸收光譜和拉曼光譜技術(shù)。

4.1 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

紅外吸收光譜技術(shù)中最常用的為FT-IR[50-51]，其分辨率高，基于紅外光能量的吸收，反映生物大分子的分子振動信息，過程快速，易于操作，可應(yīng)用于臨床真菌檢測。Mohammed[52]等分析了FTIR 在皮膚真菌和酵母菌診斷中的可能性，并肯定了它的應(yīng)用價值。但是FT-IR 也存在一些不足，如后期需要對信息進(jìn)行合理的化學(xué)計量處理、光譜數(shù)據(jù)庫不全面等。FT-IR 的另一個缺點(diǎn)是水分子有較強(qiáng)的紅外吸收，可能掩蓋其他光譜特征并干擾光譜，因此用于FT-IR 的樣品需要在早期進(jìn)行干燥以避免水干擾[53-54]。

4.2 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜是一種散射光譜，當(dāng)散射光譜和入射光頻率不同時，可分析得到分子振動信息，用于分子結(jié)構(gòu)研究。蛋白質(zhì)、糖類及核酸等大分子都能夠產(chǎn)生特異的拉曼指紋光譜[55]。樣品吸附在金屬納米顆粒上進(jìn)行檢測可增強(qiáng)拉曼光譜信號，稱為表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)[56-57]。該方法可以避免或減少復(fù)雜的前處理過程中真菌失活，檢測速度快，而且能夠在接近自然的狀態(tài)下研究生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化，已用于檢測皮膚癬菌、白念珠菌等，還須不斷擴(kuò)充光譜數(shù)據(jù)庫。此外，紫外共振拉曼光譜法也逐漸用于真菌檢測[58]。

5 新技術(shù)展望

5.1 納米孔測序技術(shù)

基因組測序和核酸片段測序已經(jīng)成為臨床上越來越重要的診斷技術(shù)，但一代和二代測序設(shè)備需要較大的實(shí)驗(yàn)室空間和資本投入，而納米孔測序技術(shù)能夠較好地應(yīng)對這些問題。目前已有多家公司開發(fā)了納米孔測序儀[59]，如Oxford Nano?pore Technologies 的MinION 測序儀，最小體積約U盤大小，通過USB 端口與計算機(jī)連接，其優(yōu)勢是儀器便攜、測序讀長和檢測快速，而且與其他測序儀器相比，價格更加便宜，因此納米孔測序可能成為最有前景的測序技術(shù)。但是仍然存在一些不足，如會出現(xiàn)較多的測序錯誤等，還須進(jìn)一步優(yōu)化[27]。

5.2 人工智能技術(shù)

近年來中國在人工智能領(lǐng)域快速發(fā)展，人工智能技術(shù)越來越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并發(fā)揮著越來越重要的作用[60]。傳統(tǒng)的涂片鏡檢法對操作人員有較高要求且受主觀因素影響較大，Liu[12]等將人工智能技術(shù)與顯微觀察相結(jié)合，使用數(shù)字圖像處理和模式識別來獲得真菌的特征，并使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）系統(tǒng)識別糞便樣本中的真菌。將智能診斷系統(tǒng)應(yīng)用于診斷，有望極大地減輕臨床醫(yī)生和影像醫(yī)生的工作量，同時使患者能夠獲得早期診斷和及時治療，具有十分廣闊的發(fā)展前景。

6 結(jié)語

隨著真菌感染病例的逐年增多，及時掌握和正確使用檢測技術(shù)對于真菌感染的防治有重大指導(dǎo)意義。傳統(tǒng)檢測方法操作簡單，成本較低，但耗時長，過多依賴人工。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了越來越多的新技術(shù)，分子生物學(xué)檢測潛力日益突出，新一代測序技術(shù)更加快速便捷，人工智能可協(xié)助醫(yī)生診療，這些新技術(shù)都顯示出巨大的應(yīng)用前景[59-60]。通過對真菌檢測技術(shù)的全面了解以及不斷優(yōu)化創(chuàng)新，真菌感染早期診斷的世界難題終將被攻克。