小檗紅堿及其衍生物的制備與應(yīng)用研究進(jìn)展

王國(guó)勝，齊飛，高藝偉，奚洋，張子陽

（沈陽化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110042）

小檗紅堿 （berberrubine，BRB），也叫鹽酸小檗紅堿，分子式：C19H16NO4·Cl，相對(duì)分子質(zhì)量：357.79，純度98%以上，紅色晶體，熔點(diǎn)245℃，可溶于酸性溶液，不溶于石油醚、氯仿等溶劑。儲(chǔ)藏要求避光、低溫下保存，保存溫度在2～8℃。小檗紅堿的分子結(jié)構(gòu)特征與小檗堿的一樣同屬于異喹啉結(jié)構(gòu)，也稱為脫甲基小檗堿，存在于許多中藥材中，如黃連，黃柏等。近年來，隨著小檗堿的臨床應(yīng)用以及開發(fā)研究的深入［1-6］，小檗堿與小檗紅堿的轉(zhuǎn)化關(guān)系［7］，構(gòu)效關(guān)系［8，9］以及小檗紅堿的藥理與毒理作用［10，11］引起了廣泛的重視，臨床中發(fā)現(xiàn)小檗紅堿也具有一定的體外抗菌活性、體內(nèi)抗腫瘤活性以及調(diào)脂活性［12，13］，由于其作用機(jī)制與他汀類藥物完全不同且有良好的安全性，被認(rèn)為有望取代他汀類藥物的新靶標(biāo)藥。目前，隨著對(duì)小檗紅堿以及小檗紅堿衍生物的藥用以及臨床應(yīng)用研究的深入，對(duì)小檗紅堿的制備必將引起關(guān)注。未來，小檗紅堿的工業(yè)化生產(chǎn)將成為急需解決的問題。同樣，加大小檗紅堿及其衍生物的制備技術(shù)、藥用機(jī)制、臨床應(yīng)用以及應(yīng)用領(lǐng)域的開發(fā)等無論在學(xué)術(shù)研究還是新藥開發(fā)領(lǐng)域都會(huì)成為新的熱點(diǎn)和增長(zhǎng)點(diǎn)。

1 小檗紅堿的制備技術(shù)

1.1 天然產(chǎn)物的提取分離

小檗紅堿存在于黃連、黃柏、三顆針等中藥材中很早就已經(jīng)被證明了。對(duì)鹽黃柏、二妙丸等的比照樣品分析表明［14-16］，其中，小檗紅堿相對(duì)于小檗堿的含量較少，含量?jī)H僅在0.2%～1.3% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。小檗紅堿最早是從歐小檗 （Berberis vulgaris L）中分離得到的，隨后，從黃連中分離出小檗紅堿也獲得成功［17，18］。對(duì)裂葉星果草采用乙醇提取，經(jīng)過熒光切割、柱色譜純化和離心薄層制備得到鹽酸小檗紅堿［19］。由于中藥材中小檗紅堿的含量較少，由天然產(chǎn)物提取小檗紅堿的技術(shù)難以工業(yè)化。但是，提取得到的小檗紅堿的重要信息，如熔點(diǎn)、紫外、紅外、核磁、質(zhì)譜等的分析數(shù)據(jù)為小檗紅堿的物性、性能以及開發(fā)利用提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

1.2 中藥的炮制轉(zhuǎn)化

采用高效液相色譜測(cè)定不同炮制方法、不同炮制溫度對(duì)黃連酒灸品種的生物堿含量的變化研究表明［20］，酒灸黃連隨著加熱溫度的增加，生物堿在160℃時(shí)的含量最高，在170℃時(shí)出現(xiàn)新的化學(xué)成分小檗紅堿。對(duì)黃柏及其飲片的炮制過程中生物堿成分的變化研究［21-24］，得到同樣的結(jié)論。即隨著炮制溫度的變化，黃柏中的生物堿的成分發(fā)生了變化，生成新的化學(xué)成分小檗紅堿，其含量隨著溫度的升高而增加。上述研究不僅僅發(fā)現(xiàn)了生物堿成分的變化，更主要的是轉(zhuǎn)化的溫度，以及轉(zhuǎn)化為新的化學(xué)成分是小檗紅堿，這為以小檗堿為原料，通過去甲基化轉(zhuǎn)化為小檗紅堿的化學(xué)合成提供了有力的佐證。

1.3 小檗堿的代謝轉(zhuǎn)化

采用混合人肝微粒體和重組人源細(xì)胞色素酶對(duì)小檗堿的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究表明［25］，小檗堿在體外混合人肝微粒體溫孵體系中的主要代謝途徑為O-去甲基化，可生成小檗紅堿。在對(duì)鹽酸黃連堿和小檗紅堿在人源細(xì)胞單層模型中的吸收研究表明［26］，給大鼠灌胃小檗堿，在血漿中檢測(cè)到其主要代謝產(chǎn)物為小檗紅堿。對(duì)小檗堿的藥動(dòng)學(xué)和代謝研究表明［27］，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)健康自愿者和患者的血漿進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小檗堿的主要代謝產(chǎn)物是小檗紅堿，且小檗紅堿比小檗堿的親油性強(qiáng)，其藥物活性也比小檗堿強(qiáng)。對(duì)小檗堿的代謝過程以及代謝產(chǎn)物的研究，不僅證明了小檗堿的代謝產(chǎn)物為小檗紅堿，也為生物轉(zhuǎn)化制備小檗紅堿提供了新的思路。

1.4 小檗堿的脫甲基化

將鹽酸小檗堿經(jīng)過氨水和氯仿處理得到氯仿小檗堿，將其裝入硅膠柱，用氯仿與甲醇過柱洗脫，能得到小檗紅堿［28］。同樣，小檗堿經(jīng)過層析柱發(fā)生脫甲基化也能得到小檗紅堿［29］。研究表明［7，30］，小檗堿和小檗紅堿可以互相轉(zhuǎn)化。目前，通過將小檗堿脫甲基化制備小檗紅堿已成為實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常采用的方法。

1）真空熱解技術(shù)［31］。以小檗堿為原料，在高于160℃條件下，采用高溫脫甲基化可得到小檗紅堿，但是收率低，副產(chǎn)物多，分離提純困難。在真空條件下，或者在二氧化碳與氮?dú)獾榷栊詺怏w保護(hù)得條件下，可減少副產(chǎn)物，提高收率。

2）成酯水解技術(shù)［32］。以小檗堿為原料，在鹽酸吡啶及醋酐中回流，C9位脫去甲基，同時(shí)酯化生成9-?；?9-去甲基小檗堿。在氫氧化鈉溶液中水解生成小檗紅堿，總收率71%～88%。該法脫甲基溫度低 （140℃），產(chǎn)物純度和收率較高。

3）微波輔助技術(shù)［33，34］。以高沸點(diǎn)穩(wěn)定性高的極性介質(zhì)DMF為溶劑，采用微波輔助技術(shù)，400W，輻射15min，收率可達(dá)到98%。相比較真空熱解法，具有快速、節(jié)能、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)。

4）催化脫甲基化［35］。以鹽酸小檗堿為原料，采用甲苯為溶劑，加入無水氯化鋁，在110℃條件下，回流反應(yīng)1h，可制取小檗紅堿。該方法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)溫度可顯著降低，但是，仍然需要分離提純。

5）置換脫甲基［36］。鹽酸小檗堿與鹽酸吡啶在160～170℃的油浴中攪拌加熱至溶解，保溫條件下，繼續(xù)攪拌，混合物固化，冷卻后，加無水乙醇溶解，過濾得到固體，溶于熱水中，活性炭脫色，濾液加丙酮后，放置得到紅色針狀結(jié)晶。該反應(yīng)可能是鹽酸吡啶通過置換反應(yīng)奪甲基生成甲基吡啶鹽酸鹽，該方法提純精制過程繁瑣，且收率低。

以小檗堿為原料，通過去甲基化得到小檗紅堿是目前小檗紅堿制備的主要技術(shù)路線，僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，還沒有工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)。該技術(shù)不僅佐證了中藥炮制過程中小檗堿含量變化的情況，而且也證明了小檗堿與小檗紅堿的可逆性制備［7］。但是，必須清醒地認(rèn)識(shí)，該技術(shù)是以小檗堿為原料合成小檗紅堿，不僅消耗了產(chǎn)量有限的小檗堿，同時(shí)也注定了增加了藥物的成本。研究開發(fā)替代化學(xué)原料的小檗紅堿的化學(xué)合成方法是未來研究的熱點(diǎn)。

2 衍生物與藥理作用

目前，對(duì)小檗紅堿的代謝過程及動(dòng)力學(xué)研究表明［7，10，11，37-39］，小檗紅堿在人體內(nèi)可快速吸收，且分布在腎、肝、脾和心等臟器，可經(jīng)過肝與腎代謝。一定劑量的小檗紅堿對(duì)腎臟呈現(xiàn)毒性，但是，C-9位的糖脂化物無毒，這也為小檗紅堿C-9位衍生物的合成及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。隨著小檗紅堿的藥理作用研究發(fā)現(xiàn)［40］，其抗腫瘤作用、降血脂血糖作用、抗微生物作用、抗炎作用、對(duì)心血管系統(tǒng)的作用以及抗氧化作用引起了廣泛的關(guān)注，而且，小檗紅堿的衍生物表現(xiàn)出優(yōu)于小檗紅堿本身的臨床醫(yī)療效果，尤其對(duì)小檗紅堿的C-9位的修飾改性成為了研究熱點(diǎn)［41-48］。

2.1 C-9-O-衍生物

2.1.1 親油性

1）抗癌活性。以真空裂解小檗堿得到的小檗紅堿為原料，在乙腈溶液中，堿性條件下與氯芐回流反應(yīng)合成9-O-芐基化合物，通過常規(guī)的倍半稀釋法和MTT法分別進(jìn)行抗菌和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明［49］，衍生物的活性有所提高，抗菌活性比小檗堿提高30倍，含氯素芐基引入后活性更強(qiáng)，對(duì)人肺癌和人宮頸癌細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用。將萜烯基引入C-9-位生成9-O-萜烯基小檗堿［50］，表明親油性基團(tuán)的引入，表現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制性和活性。

2）抗菌抗炎活性。以氮?dú)獗Ｗo(hù)熱解小檗堿得到的小檗紅堿為原料，在乙腈溶液中，與4-氯丁氧苯反應(yīng)得到9-苯氧丁基小檗堿，體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明［51］，對(duì)常見致病菌體現(xiàn)了良好的抗菌活性，對(duì)耐藥產(chǎn)氣菌的效果最佳，其次是大腸桿菌、痢疾桿菌、鏈球菌和耐甲氧西林金葡菌，其抗菌效果其中對(duì)耐藥產(chǎn)氣菌和大腸桿菌的抑制作用最為明顯，與小檗堿相比提高了16倍。將甲硝唑與苯三唑引入 C-9-位［52，53］，均表現(xiàn)出較好的抗菌性作用。將含有CF3—，NO2—，CN—等基團(tuán)的甲苯引入C-9-位［54］，表現(xiàn)出較高的抗菌和抗真菌活性，作用機(jī)制為衍生化合物通過氫鍵、π-π，π-陽離子、π-陰離子等與目標(biāo)DNA緊密鍵合。

3）動(dòng)脈粥樣硬化。采用高溫真空條件下，選擇性脫出9-位甲基，在堿性條件下，以酯鍵、酰胺鍵等作為連接臂，在小檗紅堿的9-位引入短鏈烷基、剛性基團(tuán)、雜環(huán)以及取代芳環(huán)等不同類型取代基，涉及合成多個(gè)衍生物。對(duì)其抑制由白細(xì)胞介素 （IL-6）誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活因子 （STAT）的磷酸化進(jìn)行研究表明［55］，9-位剛性基團(tuán)的引入有利于活性的提高，通過抑制過程磷酸化，進(jìn)而抑制介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，為新型抗動(dòng)脈粥樣硬化候選藥物提供了良好的構(gòu)效關(guān)系和科學(xué)依據(jù)。

4）阿爾茲海默癥。將鄰苯二酚和對(duì)苯二酚引入C-9-位［56］，其衍生物表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化活性以及淀粉樣蛋白的Aβ聚集，其中鄰苯二酚衍生物表現(xiàn)出優(yōu)異的阿爾茲海默癥治療效果。將含氮苯環(huán)引入C-9-位［57］，其衍生物具有較好的抗膽堿酯酶活性與抗炎活性，是有潛力的抗阿爾茲海默癥化合物。將環(huán)己基氨基和烷基苯酚引入C-9-位［58，59］，其衍生物與乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的動(dòng)力學(xué)以及分子模擬研究表明，兩者的對(duì)接模式是通過催化活性位與外圍陰離子位點(diǎn)連接的。將噻吩以及氟代苯甲?；鶊F(tuán)引入C-9-位［60］，其衍生物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制活性研究表明，修飾的小檗堿具有抗HIV活性，且毒性較小。

5）降脂降糖。將親油性基團(tuán)，如烷基醇、芳基醇等引入C-9-位［61］，構(gòu)建系列酯類或者醚類活性化合物。研究表明酯類 （棕櫚酸酯）的引入有明顯的降膽固醇作用，可作為安全的口服降脂藥物，并且可提高口服小檗紅堿的生物利用度。將肉桂酸引入C-9-位［62］，生成肉桂酸小檗堿酯，顯著提高了低血糖癥活性，可作為可開發(fā)的新型抗2-型糖尿病藥物。

2.1.2 親水性

對(duì)小檗堿的C9位進(jìn)行親水性修飾，合成了9-O-小檗堿糖苷同系物。對(duì)SD大鼠灌胃給藥實(shí)驗(yàn)表明［63］，9-O-小檗堿糖苷同系物在口服生物利用度方面與小檗堿相比有顯著的優(yōu)勢(shì)，為小檗堿的9.3倍。對(duì)大鼠灌胃給藥9-O-小檗堿葡萄糖苷，結(jié)果表明［64］，9-O-小檗堿葡萄糖苷具有明顯的體內(nèi)降血糖與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝異常能力。

2.1.3 二聚體

通過小檗紅堿與6-海藻糖單對(duì)甲基苯磺酸酯和6，6’-海藻糖雙對(duì)甲基苯磺酸酯的反應(yīng)得到單聯(lián)和雙聯(lián)衍生物。采用熒光光譜實(shí)驗(yàn)分析其與DNA作用發(fā)現(xiàn)［65］，單聯(lián)體衍生物與DNA的結(jié)合能力與小檗堿相當(dāng)，而雙鏈體衍生物與DNA的結(jié)合能力比小檗堿提高了約7倍。由聚四乙二醇醚將兩個(gè)小檗紅堿鏈接得到二聚體［66］，在二聚體與銅離子配比為1∶1時(shí)，通過先插入DNA使其多醚鏈形成具有金屬離子配位能力的構(gòu)型，然后與銅離子形成對(duì)DNA具有斷裂功能的活性中心。對(duì)乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的作用研究表明［67，68］，可形成雙抑制位點(diǎn)，顯著提高其抑制作用。將黃芩黃素引入C-9-位［69］，形成小檗堿與黃芩黃素的偶聯(lián)體，等同于二聚體聯(lián)合兩個(gè)藥的效果，具有降脂防聚集作用，是潛在的肥胖治療藥物。研究表明［70-73］，二聚體或者偶聯(lián)體衍生物與DNA之間的作用均比單體的小檗堿或者小檗紅堿有所增強(qiáng)。

2.2 C-12，13-衍生物

2.2.1 C-12-

將氨甲基引入小檗紅堿的C-12-位［74］，抗糖尿病活性的增強(qiáng)表明有利于2-型糖尿病的控制與治療。以正丁烷為溶劑，將咪唑與甲醛在110℃，進(jìn)行小檗紅堿的 C-12-位修飾［75］，通過其與DNA作用研究表明具有較強(qiáng)的抗菌活性。將小檗紅堿進(jìn)一步還原為四氫小檗紅堿，繼續(xù)在其C-12-位引入苯并咪唑基團(tuán)，其衍生物與DNA作用研究表明［76］，含氟苯并咪唑基團(tuán)抗菌和殺真菌活性最好。

2.2.2 C-13-

以小檗堿為原料，在甲苯溶液中，采用氯化鋁催化法，回流條件下去甲基得到小檗紅堿。分別在小檗紅堿的8、13位引入乙?；⑵S基和 （3′，5′-二硝基）芐基得到不同的小檗紅堿衍生物。對(duì)金黃色葡糖球菌、白色念珠菌、魯西特念珠菌、克柔念珠菌和隱球菌的抗菌實(shí)驗(yàn)表明［35］，在小檗紅堿的13位引入芐基的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，能夠顯著提高抗菌活性，可能是修飾的產(chǎn)物具有更高的新脂性，可增強(qiáng)細(xì)胞膜的滲透性。在C-13-位引入4-異丙基苯基團(tuán)或者叔丁基苯基團(tuán)［77，78］，都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，且口服安全性相對(duì)較高。

在保留小檗紅堿的異喹啉結(jié)構(gòu)、二亞甲氧基、氮三角形結(jié)構(gòu)以及C-9-甲氧基的同時(shí)，深入研究不同位置、不同基團(tuán)的修飾與衍生，甚至二聚體或者偶聯(lián)體的開發(fā)，尤其是結(jié)合已經(jīng)證明有效的小分子作用基團(tuán)的引入，都將是小檗紅堿及其衍生物未來開發(fā)和研究的熱點(diǎn)。

3 小結(jié)

1）利用代謝轉(zhuǎn)化生成小檗紅堿的原理，積極開展生物合成小檗紅堿不失為一條可行的方案。

2）加快研究替代原料，積極開展化學(xué)合成小檗紅堿，不僅可減少小檗堿的消耗，同時(shí)可降低生產(chǎn)成本，并工業(yè)化生產(chǎn)小檗紅堿，為小檗紅堿的深入研究和應(yīng)用開發(fā)提供制支撐。

3）繼續(xù)對(duì)小檗紅堿的代謝以及毒性的深入研究，實(shí)現(xiàn)可控給藥或者吸收，提高口服的絕對(duì)生物利用度。

4）加大對(duì)小檗紅堿及其衍生物的開發(fā)，開展小檗紅堿及其衍生物在抗阿爾茲海默癥、抗癌以及降糖等方面的研究和臨床應(yīng)用研究，必將帶來較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

5）利用酸堿條件下小檗紅堿的酮與烯醇的互變異構(gòu)原理，開發(fā)小檗紅堿基化學(xué)傳感器新技術(shù)。

6）在保持小檗紅堿的作用靶點(diǎn)的前提下，將已經(jīng)證明的有效治療小分子與其二聚或者偶聯(lián)，未來可能產(chǎn)生神奇的治療效果。