超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)合調(diào)味料中愛德萬甜的不確定度評定

張小剛，王霞，王衛(wèi)東，范艷紅，孫洪峰，*

（1.康師傅控股有限公司食品安全研究中心，上海201101；2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，上海201708；3.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇徐州221111）

愛德萬甜（N-{N-[3-（3-羥基-4-甲氧基苯基）丙基]-L-a-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸-1-甲酯）是一種新型低熱量甜味劑，其甜度是蔗糖的20 000 倍[1]。美國食品藥品監(jiān)督管理局、歐盟食品安全局批準愛德萬甜可以作為甜味劑和增味劑加入至食品中[2-3]。我國也于2017年10 月由國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布第8 號公告正式批準愛德萬甜可作為食品添加劑用于發(fā)酵乳、飲料、復(fù)合調(diào)味料等制品中[4]。

不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度，是檢測結(jié)果的重要組成部分。通過對檢測過程中各不確定度來源進行評定來反映檢測結(jié)果的可靠性。食品中常用的甜味劑主要有三氯蔗糖、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素等物質(zhì)，相關(guān)檢測方法及不確定度評定報道較多[5-8]。目前，國內(nèi)外測定愛德萬甜的方法較少，主要為液相色譜法[9-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]。而關(guān)于復(fù)合調(diào)味料中愛德萬甜的不確定度評定的相關(guān)文獻尚未見發(fā)表。根據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》規(guī)定[15]，對試驗中的不確定度來源進行分析并建立相應(yīng)的數(shù)學模型。通過對數(shù)學模型中各分量的不確定度評定，找到影響結(jié)果可靠性的主要因素，為本試驗及其他類似測定的正確評價提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Triple Quad 4500 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國SCIEX 公司；5810R 冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Milli-Q 超純水儀：美國 Millipore 公司。

甲醇、乙腈、正己烷、甲酸（色譜純）：德國CNW 公司；水為超純水；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18、石墨化炭黑（graphitizing of carbon black，GCB）吸附劑：上海安譜實驗科技股份有限公司；愛德萬甜標準品（純度≥97.0%）：美國SIGMA 公司。

1.2 試驗方法

準確稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于50 mL 塑料離心管中，加入 10 mL 甲醇-水（50 ∶50，體積比）振蕩提取10 min，8 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中。殘留物再用 10 mL 甲醇-水（50 ∶50，體積比）振蕩提取10 min，離心，合并兩次上清液并定容至25 mL。取1 mL 上清液于裝有200 mg C18和100 mg PSA的2 mL 塑料離心管中，渦旋混勻1 min，10 000 r/min離心2 min，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾至進樣瓶中，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）分析。

1.3 數(shù)學模型

根據(jù)方法建立測定愛德萬甜的數(shù)學模型如下：

式中：X 為樣品中愛德萬甜的含量，μg/kg；c 為由標準曲線得出的待測液中愛德萬甜的濃度，μg/L；V 為定容體積，mL；frep為重復(fù)性因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)合調(diào)味料中愛德萬甜的不確定度主要有以下幾個來源：

1）標準溶液配制引入的不確定度；

2）樣品稱量引入的不確定度；

3）樣品定容引入的不確定度；

4）測量重復(fù)性引入的不確定度；

5）最小二乘法擬合引入的不確定度。

2.2 各分量不確定度的計算

2.2.1 標準溶液配制引入的不確定度

2.2.1.1 標準物質(zhì)不確定度

查標準物質(zhì)證書，愛德萬甜標準品的純度≥97.0%，按97%～100%矩形分布考慮，半寬度為3%/2=1.5%，包含因子屬B 類評定，愛德萬甜標準物質(zhì)的不確定度為：

2.2.1.2 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度

標準品稱量為100 mg，天平的最大誤差為0.2 mg，按矩形分布考慮，包含因子則由天平的最大允許誤差引入的不確定度為：

3）配制標準儲備液過程中由定容體積變化引入的不確定度

標準品配制所使用的10 mL A 級容量瓶20 ℃時的容量允差為±0.02 mL[16]，按矩形分布考慮，包含因子屬B 類評定，則：

實驗室的溫度波動范圍一般為±5 ℃，20 ℃水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，甲醇體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3/℃，相較于水和甲醇的體積膨脹，容量瓶的體積膨脹可以忽略不計[17]。試驗過程中使用的甲醇溶液（1 ∶1，體積比）的平均體積膨脹系數(shù)為 7.05×10-4/℃，由此引起的體積變化為：

按矩形分布考慮，則由體積變化引入的不確定度為：

由公式（3）、（4），合成標準儲備液定容的相對標準不確定度為：

使用100 μL 移液槍稀釋標準溶液，其容量允差為±1.0 μL，按矩形分布由此引入的相對不確定為稀釋過程中溫度對體積的變化引入的相對不確定度urel（T2）=0.002 035。容量瓶和移液槍各使用3 次，故標準溶液稀釋過程所引入的相對不確定度為：

由公式（1）、（2）、（5）、（6）合成愛德萬甜標準溶液配制所引入的相對不確定度：

2.2.2 樣品稱量引入的相對不確定度

待測復(fù)合調(diào)味料樣品使用萬分之一天平進行稱量，根據(jù)電子天平檢定證書，其最大允許誤差為±0.5 mg，按矩形分布考慮，其相對標準不確定為：

2.2.3 樣品定容引入的相對不確定度

2.2.3.1 25 mL 容量瓶引入的不確定度

復(fù)合調(diào)味料樣品溶液定容所使用的25 mL A 級容量瓶20 ℃時的容量允差為±0.03 mL，按矩形分布考慮，包含因子屬B 類評定，則：

2.2.3.2 溫度影響溶液體積引入的不確定度

根據(jù)2.2.1 中所述，使用25 mL 容量瓶定容時體積的變化為：

按矩形分布考慮，則由體積變化引入的不確定度為：

由公式（9）、（10）合成樣品定容體積引入的相對標準不確定度：

2.2.4 測量重復(fù)性引入的相對不確定度

重復(fù)測定復(fù)合調(diào)味料樣品6 次，測得值分別為51.10、50.70、49.10、50.43、50.03、48.80 μg/kg，根據(jù)賽貝爾公式，單個測定值的標準偏差為：

由重復(fù)測定引入的相對不確定為：

式中：n 為樣品測試次數(shù)；Xi為樣品的測定值；X為重復(fù)測定n 次的平均值。

2.2.5 最小二乘法擬合引入的相對不確定度

配制愛德萬甜的校準工作溶液，濃度分別為0.2、0.5、2.0、5.0、10、20 μg/L，用 UPLC-MS/MS 測得其相應(yīng)峰面積為 16 170、37 137、153 55、362 099、737 041、1 450 435。采用最小二乘法進行擬合，得到直線方程y=72 498x+3 879.5，相關(guān)系數(shù) r2=0.999 9。

按下列公式計算最小二乘法擬合引入的不確定度：

其中：Sr為峰面積測量的標準偏差：

式（13）、（14）中，Yi為標準曲線各濃度點對應(yīng)的峰面積；Y 為標準曲線各濃度點帶入至標準曲線中計算所得峰面積；b 為擬合曲線的斜率；P 為樣品重復(fù)測定次數(shù)；n 為標準溶液質(zhì)量濃度的個數(shù)；c0為樣品測定的平均濃度，μg/L；（c 為標準曲線濃度的平均值，μg/L；ci為標準曲線各濃度的平均值，μg/L。

標準曲線擬合的相對不確定度為：

2.3 合成標準不確定度及擴展不確定度

由公式（7）、（8）、（11）、（12）、（15）得到本試驗的合成相對標準不確定度為：

樣品中愛德萬甜的合成標準不確定度為：u（X）=0.029 7×50.03=1.49 μg/kg

擴展不確定度由合成標準不確定度乘以包含因子得到，取置信水平95%，則k=2，試樣中愛德萬甜的擴展不確定度為：

用UPLC-MS/MS 測定復(fù)合調(diào)味料中愛德萬甜，當取樣量為1.000 0 g，k=2（置信水平95%），理論添加水平為50.00 μg/kg 時，測得復(fù)合調(diào)味料中愛德萬甜為（50.03±2.98）μg/kg。

3 結(jié)論

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對復(fù)合調(diào)味料中的愛德萬甜進行測定，建立了不確定度來源的數(shù)學模型。通過比較各分量不確定度的大小發(fā)現(xiàn)最小二乘法擬合和標準溶液配制是不確定度的主要來源，樣品稱量、樣品定容、重復(fù)性測定所引入的不確定度相對較小。因此，在測定過程中，要嚴格按照規(guī)范操作、使用合格的檢定器具、保證儀器處于最佳狀態(tài)，盡可能減少干擾，以保證檢測結(jié)果的準確性。