雞肉中丙酸睪酮殘留表面增強拉曼光譜檢測條件的優(yōu)化

王婷，劉木華，袁海超，趙進(jìn)輝，徐寧，陳健，胡圍，宋怡欣

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備重點實驗室，江西南昌330045）

丙酸睪酮（testosterone propionate，PTS）是一種功效類似于睪酮的甾類同化激素。養(yǎng)殖戶在雞等家禽中使用PTS，以提高食欲、促進(jìn)生長和增加體脂[1]。經(jīng)研究表明，含PTS 的雞肉通過食物鏈進(jìn)入人體后，經(jīng)過消化吸收進(jìn)而對人體發(fā)育產(chǎn)生影響，如兒童早期性發(fā)育、誘發(fā)癌癥、內(nèi)分泌失調(diào)等[2]。中國已經(jīng)頒布了對禽類禁止使用PTS 的條例，為了保障食品健康安全，必須提供一種快速和高靈敏度的分析方法，找到其檢測條件優(yōu)化結(jié)果，便于快速檢查市場上雞肉的安全。

目前，對于PTS 激素殘留主要的檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法、毛細(xì)管電泳法、熒光光譜分析法和拉曼光譜法[3-5]。表面增強拉曼光譜技術(shù)（surface-enhanced Raman scattering，SERS）作為一種穩(wěn)定性強、抗干擾、方便快捷的方法，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物領(lǐng)域、食品安全和環(huán)境檢測等領(lǐng)域[6]。近年來，SERS 技術(shù)已被應(yīng)用于家禽體內(nèi)激素殘留檢測，如陶進(jìn)江等[7]使用QE65000 型拉曼光譜儀，對鴨肉中丙酸睪酮、乙烯雌酚、諾龍3 種性激素類藥品進(jìn)行SERS 光譜采集，確定了藥品中3 種激素的拉曼特征峰，探究出了不同檢測條件的最優(yōu)量，并建立了鴨肉中性激素殘留標(biāo)準(zhǔn)曲線。馮超等[8]使用RM-200 型便攜式拉曼光譜儀，對17β-雌二醇、雌三醇和乙烯雌酚3 種雌激素類藥品進(jìn)行拉曼光譜采集，確定其3 種激素的特征峰并進(jìn)行了分析對比和模擬計算，結(jié)果表明，運用SERS 技術(shù)可以快速檢測出17β-雌二醇、雌三醇和乙烯雌酚等三種激素。ZHAO J H 等[9]采用SERS 技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，運用自適應(yīng)迭代加權(quán)懲罰最小二乘法和最小二乘支持向量機(jī)對豬肉中克萊多巴胺和鹽酸克倫特羅殘留進(jìn)行快速檢測和識別。LIN S C 等[10]采用SERS 技術(shù)快速、簡單的檢測違禁魚類藥物-結(jié)晶紫和孔雀石綠，顯示了SERS 技術(shù)在違禁魚類藥物快速篩選中的應(yīng)用潛力。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)以雞肉中PTS 為研究對象，對雞肉中PTS殘留檢測條件進(jìn)行優(yōu)化分析的研究。本研究內(nèi)容運用SERS 技術(shù)對雞肉中PTS 殘留的檢測條件（金膠加入量、含PTS 的雞肉提取液加入量、硫酸鎂溶液加入量以及反應(yīng)時間）進(jìn)行優(yōu)化分析，對檢測禽肉中PTS 殘留快速檢測的實現(xiàn)具有一定的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場；PTS 標(biāo)準(zhǔn)品（純度約為99%）：南昌精科科學(xué)儀器有限公司；四氯金酸（其中金含量≥49%）：西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；無水乙醇、乙腈、正乙烷、檸檬酸三鈉、硫酸鎂（均為分析純）：南昌精科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

拉曼光譜儀（QE65000 型）：美國海洋光學(xué)公司；電子天平（FA1004B 型）：上海上平儀器有限公司；高速組織勻漿機(jī)（DS-1 型）：上海標(biāo)本模型廠；漩渦振蕩器（VORTEX-5 型）：江蘇海門市其林貝爾儀器有限公司；低速離心機(jī)（JW-1024）：安徽嘉文儀器裝備有限公司；氮吹儀（HSC-24B）：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；新世紀(jì)紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限公司；萬用電磁爐（DK-98-‖）：北京科技永興儀器有限公司；實驗室全自動RO 純水機(jī)：美國Teledyne 水質(zhì)公司；超聲波清洗器（JK-50B 型）：合肥金尼克機(jī)械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 PTS 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取10 mg 的PTS 標(biāo)準(zhǔn)品，用少量甲醇溶于100 mL棕色容量瓶中，超聲溶解后冷卻至25 ℃，再用甲醇定容至刻度，得到100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 空白雞肉提取液制備

稱取5 g 勻漿雞肉放入50 mL 離心管中，加入20 mL乙腈，經(jīng)渦旋 1 min，超聲振蕩 10 min，4 200 r/min 離心10 min，殘渣用乙腈重復(fù)萃取一次。合并上清液，加入2 g 無水硫酸鈉，渦旋1 min，在60 ℃下氮氣吹至約10 mL 溶液，4 200 r/min 離心 10 min，取出液體過濾后，加入10 mL 正己烷，經(jīng)渦旋1 min，超聲振蕩10 min，離心4 200 r/min，10 min 后取下層乙腈相，在30 ℃下氮吹至近干，加入適量甲醇定容至20 mL 處，得到本研究的空白雞肉提取液。

1.3.3 含PTS 雞肉提取液制備

稱取約10 mg PTS 標(biāo)準(zhǔn)品放入100 mL 棕色容量瓶中，加入少量的空白雞肉提取液，超聲溶解冷卻至25 ℃，再用空白雞肉提取液定容，得到含100 mg/L PTS的雞肉提取液。

1.3.4 金膠的制備

100 mL 0.01%氯金酸加入到200 mL 燒杯中，放至萬用電磁爐上加熱至沸騰后，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉溶液，并不停攪拌9 min，冷卻至25 ℃后備用[11]。

1.3.5 樣本的采集

1）樣本的拉曼光譜采集：先后取不同量的金膠（0、200、300、500、700、900 μL）、不同量的含 PTS 的雞肉提取液（0、3、5、10、15、20 μL）及不同量的硫酸鎂溶液（0、30、50、70、100、120、150 μL）充分混合，置于 2 mL 石英瓶中經(jīng)不同反應(yīng)時間大小（0、1、5、10、15、20 min）后，放于拉曼儀器樣品池中進(jìn)行拉曼光譜采集。

2）樣本的可見-紫外采集方法：對納米金膠、納米金膠＋含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）＋硫酸鎂溶液兩種溶液用水進(jìn)行稀釋，用紫外可見分光光度計對稀釋后的溶液樣本進(jìn)行可見-紫外信息采集。

1.4 SERS檢測條件優(yōu)化方案

為了獲取更加靈敏的SERS 信號，同時探究出各種不同檢測條件對SERS 光譜強度的影響，關(guān)鍵是確定檢測條件優(yōu)化方案：1）反應(yīng)時間：首先來確定最優(yōu)反應(yīng)時間，以 500 μL 納米金膠加入量，加入 5 μL 含 PTS的雞肉提取液（8 mg/L），再加入 120 μL 硫酸鎂溶液，經(jīng)反應(yīng)時間 0、1、5、10、15、20 min 后，采集其拉曼光譜并對比每個時間點所對應(yīng)的SERS 光譜圖，確定最優(yōu)反應(yīng)時間。2）納米金膠的加入量：將金膠加入量分為6種（0、200、300、500、700、900 μL），每種金膠與 5 μL含 PTS 雞肉提取液（8 mg/L）、120 μL 硫酸鎂溶液充分混合，采集其拉曼光譜并觀察其SERS 光譜圖。3）待測溶液的加入量：確定了金膠的加入量后，以金膠加入量和硫酸鎂固定值，改變含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）的體積（0、3、5、10、15、20 μL）來確定含 PTS 的雞肉提取液最優(yōu)加入量。4）硫酸鎂加入量：以上確定了反應(yīng)時間、金膠加入量、待測溶液加入量的最優(yōu)條件，比較硫酸鎂溶液（0、30、50、70、100、120、150 μL）加入不同體積下的SERS 光譜，找到硫酸鎂溶液最優(yōu)加入量。所有試驗平行檢測5 次。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

1.5.1 拉曼光譜儀預(yù)處理

對QE65000 型拉曼光譜儀參數(shù)設(shè)置：激光器功率為650 mW，激光波長785 nm，并選取掃描光譜波段為400 cm-1～1 800 cm-1范圍進(jìn)行研究，分辨率 6 cm-1，積分時間10 s，積分平均2 次，平滑度為1。

1.5.2 對檢測條件定性分析數(shù)據(jù)處理方法

將不同檢測條件下的樣本溶液放入QE65000 型拉曼光譜儀樣品池中，進(jìn)行單次掃描采集數(shù)據(jù)，然后在數(shù)據(jù)分析中采用5 次測量的平均值，并且用自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法算法扣除熒光等背景信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見吸收光譜

圖1 為納米金膠、納米金膠＋含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）＋硫酸鎂溶液的紫外-可見光吸收光譜。

圖1 紫外-可見光吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectrum

從圖1a 可以看出，納米金膠的紫外-可見吸收光譜的最大吸收峰在528 nm 處，半峰寬較窄，又由圖1b可知納米金膠、含PTS 的雞肉提取液和硫酸鎂的混合稀釋液的紫外最大吸收峰約在535 nm 處，相比圖1a納米金膠的峰形，圖1b 的峰形更寬且紅移了7 nm。這說明納米金膠通過加入硫酸鎂溶液和含PTS 的雞肉提取液后，使得粒子表面的等離子共振性質(zhì)發(fā)生變化，其粒徑大小或聚集程度也發(fā)生了變化，產(chǎn)生較強的共振散射信號[12-14]。

2.2 雞肉中PTS的SERS的分析

為了確定雞肉中PTS 的特征峰，對金膠、金膠+硫酸鎂溶液、金膠+甲醇+硫酸鎂溶液、金膠+PTS 標(biāo)準(zhǔn)液+硫酸鎂溶液、金膠+雞肉提取背景溶液+硫酸鎂溶液和金膠+含PTS 雞肉提取液+硫酸鎂溶液6 種溶液進(jìn)行拉曼光譜采集，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同樣品的SERS 光譜Fig.2 Raman spectra for different samples

曲線a～f 分別是6 種溶液的SERS 光譜信號。曲線e 與曲線 d、f 相比，曲線 d、f 均在 839、918、1 092 cm-1處出現(xiàn)明顯的特征峰，而曲線e 未產(chǎn)生峰值；對曲線d、f 與 a、b、c 分析，在以上 3 處（839、918、1 092 cm-1）也均沒有峰位，故在SERS 光譜檢測條件下雞肉中PTS的特征峰處于839、918、1 092 cm-1。故此考慮將839、918、1 092 cm-1處的特征峰作為PTS 的拉曼特征峰?？紤]到納米金膠、硫酸鎂分別作活性基底和作活性劑時，對檢測雞肉中PTS 的SERS 光譜有一定干擾，出現(xiàn)一些變化，導(dǎo)致特征峰會發(fā)生突變，故此對特征峰需進(jìn)一步確定分析。因?qū)琍TS 雞肉提取液進(jìn)行最低檢測限試驗分析，當(dāng)最低檢測限為1 mg/L 時，839 cm-1和1 092 cm-1處能觀察到明顯峰值，而918 cm-1并沒有出峰，故選擇839 cm-1和1 092 cm-1拉曼位移約為分析雞肉提取液中PTS 殘留的特征峰。

2.3 反應(yīng)時間對雞肉中PTS的SERS強度的影響

當(dāng)納米金膠、含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）和0.1 mol/L 硫酸鎂溶液充分混合時，其分子間有一個相互聚集的反應(yīng)過程，在這個過程中有個決定SERS 信號增強的活性熱點，在待測溶液和增強基底混合時，這個活性熱點處會產(chǎn)生比較強的SERS 信號[15]。為了探究納米金膠、硫酸鎂溶液和待測溶液混合多久，才能產(chǎn)生最好的SERS 增強效果，取納米金膠加入量500 μL、含 PTS 的雞肉提取液加入量為 5 μL、硫酸鎂溶液加入量為120 μL 置于微型離心管中混合反應(yīng)，經(jīng)反應(yīng)時間 0、1、5、10、15、20 min 后，采集的 SERS 光譜結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同反應(yīng)時間對含PTS 的雞肉提取液的SERS 信號的影響Fig.3 Effect of different reaction time on SERS signal

當(dāng)反應(yīng)時間為0～20 min 時，在839 cm-1和1 092 cm-1處的拉曼特征峰下的SERS 強度于0 min 處產(chǎn)生最高值后快速降低至穩(wěn)定狀態(tài)，但考慮到反應(yīng)時間為0 min時，操作難度較大，如將納米金膠、含PTS 的雞肉提取液和硫酸鎂溶液快速加入同一2 mL 石英進(jìn)樣瓶中，且放入樣品池進(jìn)行采樣，這過程容易產(chǎn)生操作誤差，影響試驗結(jié)果。由圖3 又可知在1 min 時，839 cm-1和1 092 cm-1處的拉曼特征峰下的SERS 強度為次強點，說明金納米粒子與含PTS 雞肉提取液混合后，在不考慮0 min 產(chǎn)生的SERS 強度影響下，PTS 分子間與金納米粒子相互凝聚過程中其活性熱點在1 min 時，SERS 信號較強。故試驗采取1 min 作為較佳的檢測反應(yīng)時間。

2.4 納米金膠加入量對雞肉中PTS的SERS光譜強度的影響

SERS 的原理是利用金屬粒子周圍局部電場的磁場效果來增強待測分子的散射截面，放大光譜信號[16]。故此，金納米粒子基底也是影響SERS 信號強度的一個重要因素。分別將不同體積（0、200、300、500、700、900 μL） 的納米金膠與 5 μL 含 PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）、120 μL 硫酸鎂混合反應(yīng) 1 min 后，得出不同體積的金膠下含PTS 的雞肉提取液SERS 光譜圖，結(jié)果見圖4。

圖4 不同加入量的納米金膠對SERS 信號的影響Fig.4 Effect of different amount of Au nanoparticles on SERS signal

由圖4 可知，在特征峰834 cm-1和1 092 cm-1下，不同金膠的量對SERS 產(chǎn)生的影響不同，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且曲線在500 μL 金膠加入量處達(dá)到最大峰值，隨后逐漸降低。經(jīng)原因分析，當(dāng)金納米粒子的量慢慢變多時，其與PTS 分子接觸得更為充分，使得拉曼信號有所增強；當(dāng)PTS 分子與金納米粒子體積比為1 ∶100混合時，拉曼峰信號最強，增強效果最好；若此時金納米粒子量繼續(xù)增加，過多的金納米粒子會對PTS 分子形成較厚的包裹層，致使雞肉中PTS 的拉曼信號降低[17]。由此可見，500 μL 金膠為檢測條件最佳加入量。

2.5 待測溶液加入量對雞肉中PTS的SERS強度的影響

影響SERS 光譜的因素有很多，例如：不同金膠的量，反應(yīng)時間，待測溶液的加入量等，以上小節(jié)已經(jīng)分析了反應(yīng)時間、不同金膠的加入量，確定了它們的較優(yōu)效果下的值（1 min 反應(yīng)時間、0.8 mL 檸檬酸三鈉加入量，500 μL 金膠）。根據(jù)單因素試驗，分析不同待測溶液加入量對SERS 強度光譜產(chǎn)生的影響。試驗將含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）分成 5 種（0、3、5、10、15、20 μL），分別與金膠和硫酸鎂溶液混合，采集光譜信息，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同含丙酸睪酮的雞肉提取液加入量對SERS 信號影響Fig.5 Effect of different amounts of chicken extract containing PTS on SERS signal

隨著含PTS 的雞肉提取液加入量不斷增大，特征峰在839 cm-1和1 092 cm-1處的拉曼強度不斷增強。在含PTS 雞肉提取液加入量為3 μL 時，拉曼強度達(dá)到最大值，之后隨著加入量不斷增加，拉曼強度開始快速下降。對這種變換趨勢進(jìn)行分析，當(dāng)含PTS 雞肉提取液加入量為0～3 μL 時，可能是由于PTS 分子數(shù)量隨著含PTS 雞肉提取液加入量增多而不斷增多，這加大了納米金膠粒子表面吸附PTS 分子的機(jī)率，增強了 SERS 光譜的強度[7]。當(dāng)加入量大于 3 μL 后，SERS光譜強度逐漸降低，這可能是過多的含PTS 雞肉提取液中某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和脂肪雜質(zhì)等物質(zhì)增多，會影響納米金膠粒子對PTS 分子的吸附能力[18]。綜上所述，選用3 μL 為含PTS 的雞肉提取液的最優(yōu)檢測條件加入量。

2.6 硫酸鎂溶液加入量對雞肉中PTS的SERS強度的影響

當(dāng)含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）中PTS 分子吸附納米金膠表面后，能使膠體產(chǎn)生凝固效應(yīng)，加入適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)會誘導(dǎo)和激活膠體，改變凝固狀態(tài)，進(jìn)而對SERS 光譜起到增強效果[19-20]。為了探究出硫酸鎂溶液對檢測雞肉中PTS 殘留的最優(yōu)檢測條件，本研究固定納米金膠和含PTS 的雞肉提取液（8 mg/L）的加入量分別為 500 μL 和 3 μL，然后加入不同體積量（0、30、50、70、100、120、150 μL）的硫酸鎂溶液（0.1 mol/L）充分混合，對每種硫酸鎂溶液體積量反應(yīng)混合后的溶液進(jìn)行SERS 采集，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同硫酸鎂溶液加入量對SERS 信號影響Fig.6 Effect of different amounts of magnesium sulfate on SERS signal

觀察在839 cm-1和1 092 cm-1特征峰下的SERS光譜強度，硫酸鎂溶液加入量為30 μL 時，此刻特征峰839 cm-1和1 092 cm-1處的拉曼強度都達(dá)到最大值，然后隨著硫酸鎂溶液加入量越來越多后，SERS 強度都比在30 μL 時產(chǎn)生的強度低。分析其原因，可能是一定量的硫酸鎂溶液通過吸附PTS 分子和膠體，對產(chǎn)生的SERS 散射信號強度起增強作用，但過多的硫酸鎂溶液可能會引發(fā)納米金膠的團(tuán)聚，使得拉曼散射強度降低[21]。故此，選擇30 μL 作為硫酸鎂溶液的最優(yōu)加入量。

3 結(jié)論

檢測條件的優(yōu)化是運用表面增強拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行食品安全快速檢測的重要環(huán)節(jié)。本研究通過探究檢測條件的最優(yōu)值，可以快速檢測出雞肉中PTS 的殘留，得出準(zhǔn)確的結(jié)果，提高試驗效率，為后續(xù)的定量建模提供了基礎(chǔ)。

對雞肉中性激素PTS 的SERS 檢測條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，研究不同檢測條件下對拉曼光譜強度的影響，并確定最優(yōu)的檢測條件為500 μL 金膠加入量，3 μL含PTS 的雞肉提取液，30 μL 硫酸鎂溶液和1 min 反應(yīng)時間。通過一系列條件的優(yōu)化研究，完善了PTS 在雞肉體內(nèi)殘留的SERS 檢測方法，為以后建立系統(tǒng)的檢測PTS 殘留的SERS 技術(shù)提供了參考，也進(jìn)一步的擴(kuò)大和發(fā)展了SERS 技術(shù)的應(yīng)用和推廣。