SPE-UPLC 法同時(shí)測(cè)定復(fù)方荊防顆粒中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量

江 麗 余 輝 曹月霞 龔春燕

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院藥劑科，江蘇南京 210042

蕁麻疹是由于皮膚、黏膜小血管擴(kuò)張及滲透性增加出現(xiàn)的一種局限性水腫反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為大小不等的風(fēng)團(tuán)伴瘙癢，可伴有血管性水腫。其發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚，可能涉及感染、變態(tài)反應(yīng)、假變態(tài)反應(yīng)和自身反應(yīng)性等。目前，西醫(yī)治療蕁麻疹主要采用抗組胺藥物治療[1-2]，但是停藥后容易復(fù)發(fā)，遷延不愈。中醫(yī)藥治療蕁麻疹積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，復(fù)方荊防顆粒是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院傳統(tǒng)中藥湯劑改變劑型制得，由防風(fēng)、荊芥、蟬衣、黃芪、制首烏、白鮮皮、地膚子等13 味中藥組成，針對(duì)蕁麻疹的外感風(fēng)邪，脾肺氣虛，應(yīng)用祛風(fēng)止癢、清熱和胃、補(bǔ)脾益肺進(jìn)行辨證施治[3-5]。通過(guò)多年的臨床觀察，復(fù)方荊防顆粒在治療蕁麻疹中有利于控制病情發(fā)展，顯著提高臨床效果。為了有效對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，本研究利用固相萃取-超高效液相色譜法（SPE-UPLC）快速同時(shí)測(cè)定君藥防風(fēng)中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，能夠明顯地減少雜質(zhì)干擾，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)復(fù)方荊防顆粒的質(zhì)量控制有重要的指導(dǎo)意義。

1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）、TUV 檢測(cè)器、Empower2 軟件（Waters 公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（AE240，梅特勒爾-托利多公司）；水浴鍋（HH-4 型，常州國(guó)華電器有限公司）；Milli-Q Synergy system 超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）；中性氧化鋁小柱（2 g/6 mL，Supelclean SPE，SIGMA 公司）；聚酰胺小柱（500 mg/6 mL，Discovery SPE，SIGMA 公司）；升麻素苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111522-201702，含量為96.2%）；5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111523-201610，含量為96.1%）；復(fù)方荊防顆粒（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院自制制劑，委托南京中山制藥有限公司加工，批號(hào)：20180701、20180702、20180703）；乙腈為德國(guó)默克公司色譜純?cè)噭?；其他試劑均為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為水-乙腈，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm[6]；流速：0.4 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)以升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

表1 梯度洗脫順序

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液制備：精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，置于同一50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取5 mL 至50 mL 容量瓶中，用20%乙腈稀釋至刻度，搖勻。制成每毫升約含升麻素苷20 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷20 μg 的對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備：取10 袋復(fù)方荊防顆粒，混勻，取適量，研細(xì)，取約9 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，稱定重量，85℃水浴回流提取1.0 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密吸取續(xù)濾液10 mL 加入中性氧化鋁小柱，用25%乙醇25 mL 洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)? mL 水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得。用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

陰性樣品溶液制備：按處方制備不含防風(fēng)的陰性制劑，并按上述供試品溶液制備方法操作，制得陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品色譜與對(duì)照品色譜在相應(yīng)保留時(shí)間處有同一色譜峰，而陰性樣品溶液無(wú)峰，提示無(wú)陰性干擾成分。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，置于同一100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成每mL 約含升麻素苷0.5 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.5 mg 的對(duì)照品溶液。分別精密吸取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶 液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL至50mL容量瓶中，以20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，得濃度為5、10、20、40、60、80 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。按上述液相色譜條件分析，測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積，并以峰面積（A）對(duì)濃度C（mg/L）進(jìn)行線性回歸。升麻素苷回歸方程為：A ＝40195C-248.67，r=1.0000；結(jié)果表明升麻素苷在5～80 mg/L 范圍內(nèi)峰面積與濃度范圍內(nèi)線性良好。5-O-甲基維斯阿米醇苷回歸方程為：A ＝42577C+12782，r=1.0000；結(jié)果表明5-O-甲基維斯阿米醇苷在5～80 mg/L 范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)行色譜分析，測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，RSD 分別為0.21%、0.62%（n=5）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取復(fù)方制劑同一批號(hào)樣品約9.0 g（批號(hào)：20180701），精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下制備方法處理，得樣品溶液，分別于0、2、4、8、12 h 測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，RSD 分別為1.27%、0.56%（n=5），結(jié)果表明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 復(fù)方荊防顆粒的超高效液相色譜圖

取同一批號(hào)的復(fù)方制劑約9.0 g（批號(hào)：20180701），精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下制備方法處理，得樣品溶液。平行操作6 次，進(jìn)行樣品分析，測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量。6 份供試品溶液所測(cè)得升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量分別為79.67、126.64 μg/袋，RSD 分別為1.02%、1.61%（n=6），表明該法重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，置于同一10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成每mL 中約含升麻素苷0.942 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷1.048 mg 的對(duì)照品溶液。

取10 袋復(fù)方荊防顆粒，混勻，取適量，研細(xì)，取約9 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，精密加入升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，稱定重量，85℃水浴回流提取1.0 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密吸取續(xù)濾液10 mL 加入中性氧化鋁柱，用25%乙醇25 mL 洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)? mL 水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液備用。各平行操作6 次。另稱取復(fù)方制劑9.0 g，精密稱定，同上述樣品溶液制備，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測(cè)定

取3 批復(fù)方荊防顆粒（批號(hào)：20180701、20180701、20180701）按照“2.2”項(xiàng)下制備方法分別制備成樣品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定3 批樣品。見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

中藥復(fù)方制劑所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)目眾多，這也是發(fā)揮多方面功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)復(fù)方荊防顆粒處方由13 味中藥組成，所含成分復(fù)雜，其中防風(fēng)為處方中的君藥。2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》一部[6]收載的防風(fēng)藥材飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷進(jìn)行了含量測(cè)定，故本實(shí)驗(yàn)經(jīng)考察選擇升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷作為定量指標(biāo)。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3.2 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中比較了不同組成的流動(dòng)相[7-17]，水-乙腈、水-甲醇、0.05%甲酸－甲醇、0.05%甲酸－乙腈4 種系統(tǒng)，結(jié)果表明，選用乙腈和水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的分離度、保留時(shí)間和色譜峰形均較好。

3.3 提取條件優(yōu)化

對(duì)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的回流提取條件進(jìn)行了考察[18-22]，在提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇和無(wú)水甲醇）和提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 h）條件下考察其提取得率，并對(duì)回流提取與超聲提取進(jìn)行比較，最終選擇了75%甲醇85℃水浴回流提取1 h。

由于本品為復(fù)方制劑，樣品中成分較多，為減少測(cè)定中其他成分的干擾，降低樣品對(duì)色譜柱的污染，制備樣品溶液時(shí)采用SPE 小柱處理樣品[23-24]。分別采用聚酰胺小柱（500 mg/6 mL）和中性氧化鋁小柱（2 g/6 mL），用水洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在聚酰胺柱上對(duì)君藥防風(fēng)兩組分有一定的吸附，故采用中性氧化鋁小柱。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)SPE 洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，比較了水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和無(wú)水乙醇去除極性大的有機(jī)雜質(zhì)的效果，發(fā)現(xiàn)25%乙醇除雜效果好且洗脫液中兩組分含量高。其實(shí)，考察洗脫溶劑體積（15、20、25、30 mL），發(fā)現(xiàn)25 mL 溶劑即可將兩組分完全洗脫下來(lái)，故選擇洗脫溶劑體積為25 mL。

3.4 UPLC 的優(yōu)勢(shì)

與HPLC 比較，UPLC 具備更高的分離度和靈敏度，同時(shí)可大大節(jié)省分析時(shí)間和溶劑用量，尤其適用于中藥制劑的質(zhì)量分析。本實(shí)驗(yàn)利用UPLC 的優(yōu)勢(shì)，10 min 便可完成對(duì)復(fù)方荊防顆粒中君藥防風(fēng)兩種成分的同時(shí)測(cè)定。該方法簡(jiǎn)單高效，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率均較好，可作為復(fù)方荊防顆粒的質(zhì)量控制方法。