DNMT1 和DNMT3a 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、臨床意義及相關(guān)性研究

高曉斌 武雪亮 趙軼峰 聶雙發(fā) 梁 峰 劉小飛 竇金山 張迎春

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000

據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2014 年我國居民結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)位居第五，嚴(yán)重威脅國民健康[1]。結(jié)直腸癌的早期診斷、規(guī)范化治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)，對(duì)患者生存時(shí)間、生活質(zhì)量有著重要影響。從分子生物學(xué)水平，尋找精準(zhǔn)度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)志物已成為結(jié)直腸癌診療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，同時(shí)為腫瘤的靶向治療提供新的技術(shù)支撐[2-4]。

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）是人類表觀遺傳學(xué)中催化并維持DNA 基化結(jié)構(gòu)和功能的重要酶家族[5]。DNMTs包含3個(gè)重要成員：DNMT1、DNMT2 和DNMT3，其中DNMT1 是目前研究最為廣泛也最為深入的酶類，其在DNA 修復(fù)和正常甲基化功能過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；DNMT2 主要負(fù)責(zé)tDNA 的甲基轉(zhuǎn)移，DNMT3 內(nèi)含3 個(gè)亞基，3a、3b 和3L，3a、3b 與啟動(dòng)子區(qū)CpG 島、DNA 的異常甲基化關(guān)系密切，而3L 系調(diào)節(jié)蛋白[6]。研究證實(shí)，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 的活性增強(qiáng)或表達(dá)上調(diào)能介導(dǎo)DNA 異常甲基化，與人類諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-10]，但在結(jié)直腸癌中的研究較少。本研究通過對(duì)結(jié)直腸癌和正常組織中DNMT1、DNMT3a 行實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）和免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析，旨在探討二者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供可靠的分子生物學(xué)標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

共納入2017 年2 月～2018 年2 月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）普通外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌組織（癌組）和癌旁正常組織（正常組）標(biāo)本，各50 例，同時(shí)收集患者完整的臨床資料。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本Takara 公司；PCR 試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒購自日本Takara公司；DNMT1、DNMT3a 和β-actin 引物由生工生物（北京）有限公司設(shè)計(jì)合成；全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010；DEPC 水購自美國Sigma 公司；兔抗人DNMT1 單克隆抗體、兔抗人DNMT3a 多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 qRT-PCR 按TRIzol RNA 試劑盒說明書提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 2 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增引物如下，DNMT1 正向引物：5′-CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT-3′，反向引物：5′-ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT-3′；DNMT3a 正向引物：5′-GCCCAAGGTCAAGGAGATTATTG-3′，反向引物：5′-TCTGCCGCACCTCGTACAC-3′；β-actin 作為內(nèi)參，正向引物：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，反向引物：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′。PCR 反應(yīng)條件：95℃變性10 min，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)：95℃變性15 s，60℃退火2 s，72℃延伸40 s，然后根據(jù)SYBRGreen 染色法行相對(duì)定量分析，熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法 將癌組織標(biāo)本連續(xù)切片4 μL貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，光鏡下觀察切片中DNMT1、DNMT3a 蛋白的表達(dá)和分布情況，每張切片選取5 個(gè)高倍視野（400×）。DNMT1 蛋白陽性主要分布于細(xì)胞核中，而DNMT3a蛋白陽性主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，均呈棕黃色顆粒。判斷標(biāo)準(zhǔn)：按染色強(qiáng)度，無著色為0 分，淡黃為1 分，深黃2 分，棕褐或棕黃3 分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，＜10%為0 分，10%～＜25%為1 分，25%～＜50%為2 分，50%～＜75%為3 分，≥75%為4 分。兩者相加＜2 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中等強(qiáng)度陽性（++），6～7 分為強(qiáng)陽性（+++），由兩名具備高級(jí)職稱的病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨(dú)立評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA 表達(dá)

以目標(biāo)基因與β-catenin 的比值作為qRT-PCR定量分析結(jié)果，癌組中DNMT1 mRNA 的表達(dá)水平（0.36±0.07）明顯高于正常組（0.09±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.951，P=0.000）；癌組中DNMT3a mRNA 的表達(dá)水平（0.33±0.06）明顯高于正常組（0.11±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.724，P=0.000）。

2.2 結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中DNMT1 和DNMT3a 蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，癌組中DNMT1 蛋白陽性表達(dá)為84.00%（42/50），明顯高于其在正常組中的表達(dá)[24.00%（12/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.545，P=0.000）；癌組中DNMT3a 蛋白陽性表達(dá)為78.00%（39/50），明顯高于其在正常組中的表達(dá)[30.00%（15/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.433，P=0.000）。見圖1。

圖1 DNMT1、DNMT3a 在結(jié)直腸正常組織和癌組織中的表達(dá)（SP，200×）

2.3 DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達(dá)均與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P ＜0.05）。TNM 分期越高，二者的表達(dá)水平越高（均P ＜0.05），伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移的患者二者的表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移的患者（均P ＜0.05），而二者的表達(dá)水平與患者腫瘤大小、分化程度均無相關(guān)性（均P ＞0.05）。見表1。

表1 DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 結(jié)直腸癌組織中DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.455，P=0.000）。見圖2。

圖2 結(jié)直腸癌組織中DNMT1 和DNMT3a 蛋白的相關(guān)性

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多個(gè)基因調(diào)控的多步驟、多階段的復(fù)雜病變過程，其中抑癌基因的失活和致癌基因的激活發(fā)揮關(guān)鍵作用，其病變機(jī)制涉及表觀遺傳學(xué)的改變，包括DNA 甲基化、染色體重塑、組蛋白修飾和lncRNA 調(diào)控[11-14]，其中DNA 甲基化是目前研究最為深入的機(jī)制。

DNMT1 是由Bestor 等[15]于1988 年在真核生物中克隆出胞嘧啶特異DNA 轉(zhuǎn)移酶，即DNMT1。DNMT1 定位于人染色體19p13.2～19p13.3，內(nèi)含1616 個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為183×103，包括3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N 端的某些特定蛋白識(shí)別靶區(qū)域、C 端的催化端和相對(duì)的未知區(qū)域[16-17]。DNMT1 主要介導(dǎo)甲基化模式的建立與維護(hù)，而DNMT3a 主要負(fù)責(zé)從頭甲基化，二者高表達(dá)可以誘導(dǎo)甲基化模式異常、致癌基因激活和抑癌基因沉默，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)DNMT1 在人類諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DNMT1 是DNA 甲基化的關(guān)鍵作用酶，其活性的增加能促進(jìn)DNA 異常甲基化。Li 等[18]通過對(duì)胰腺癌組織和相應(yīng)正常組織行免疫印跡和免疫組化法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)約80%、78.7%的癌組織中DNMT1呈高表達(dá)狀態(tài)，表明DNMT1 的異常高表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。Yang 等[19]應(yīng)用采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)54 例胃癌患者石蠟切片中DNMT1 和DNMT3a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3a 在胃癌組織中的過表達(dá)分別為54 例（64.8%）、38 例（70.4%），且二者與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。馮悅靜等[20]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)136 例肺癌患者和147 名健康對(duì)照者中DNMT1 和DNMT3a 的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組，進(jìn)一步logistic 回歸結(jié)果證實(shí)，二者蛋白的高表達(dá)能增加肺癌的發(fā)病率。

本研究顯示DNMT1 和DNMT3a 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于正常組，表明在腸黏膜癌變的過程中，細(xì)胞核中的DNMT1 和細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜上的DN MT3a 水平逐步上調(diào)，啟動(dòng)DNA 異常甲基化過程，相應(yīng)的調(diào)控基因表達(dá)受抑制，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；進(jìn)一步研究顯示，DNMT1 和DNMT3a 表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān)，且二者表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示DNMT1 和DNMT3a的表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理參數(shù)相關(guān)，二者共同參與建立、維持整個(gè)DNA 甲基化模式的過程，二者表達(dá)越高，病變?cè)絿?yán)重、預(yù)后越差。DNMT1 和DNMT3a同時(shí)作用的甲基化酶效應(yīng)是各自單獨(dú)作用的近5 倍，DNMT3a 介導(dǎo)從頭甲基化的啟動(dòng)后，半甲基化DNA底物激活DNMT1 活性使之完成后續(xù)的甲基化修飾；而DNMT1 能夠催化未修飾的DNA 發(fā)生甲基化，DNMT3a 的從頭甲基化活性則是通過甲基化的DNA 與DNMT1 酶位于N 端的變構(gòu)位點(diǎn)的靶向結(jié)合而被激活的。

綜上，DNMT1 和DNMT3a 的異常表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展有重要作用。本研究僅從基因和蛋白水平分析二者在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，其具體的異常甲基化作用機(jī)制及相關(guān)通路的研究尚不明確，這也是筆者下一步的研究方向。