EPO 在缺氧環(huán)境下對(duì)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究

蘭海霞 春 英 呼格吉樂(lè)

1.解放軍第九六九醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010051；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE），是指在圍生期發(fā)生宮內(nèi)窘迫、產(chǎn)期窒息，引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或者暫停，導(dǎo)致新生兒腦組織中樞神經(jīng)損傷，發(fā)病率、死亡率較高。有研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素（EPO）除促進(jìn)紅細(xì)胞生成外還可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。EPO是一種含有唾液酸的糖蛋白激素，與促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）結(jié)合，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用[1]。近年來(lái)EPO 逐漸開(kāi)始發(fā)展成為治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效藥物[2]，如缺氧缺血性腦病、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、創(chuàng)傷性腦損傷和糖尿病神經(jīng)病變等[3-7]。在缺血性腦損傷后，低氧的刺激使腦組織內(nèi)EPO 和EPOR 表達(dá)增高[8-10]，尤其是對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病造成的腦損傷及遠(yuǎn)期神經(jīng)預(yù)后可能有改善的作用[11]。EPO 對(duì)缺氧缺血性腦病的作用是多基因共同作用的結(jié)果，目前研究結(jié)果尚不一致[12]，而且未在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用氯化鈷（CoCl2）來(lái)構(gòu)建U251 細(xì)胞的缺氧模型，并對(duì)缺氧模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討EPO 對(duì)缺氧U251 細(xì)胞增殖能力的影響，以及EPO 對(duì)BMI1 基因在轉(zhuǎn)錄水平的影響，為研究EPO 在新生兒缺氧缺血性腦病中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，MEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號(hào)：8118247）；DPBS（Gibco 公司，批號(hào)：8117130）；0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，批號(hào)：1854874）；EPO（北京四環(huán)生物制藥公司，批號(hào)：20180330）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO 公司，批號(hào)：721200）；CCK-8 試劑（上海翊圣生物科技公司，批號(hào)：C47790）。

1.2 方法

1.2.1 CoCl2構(gòu)建U251 細(xì)胞缺氧模型及評(píng)價(jià)

將細(xì)胞分為對(duì)照組和CoCl2組，每組5 個(gè)，分別加入終濃度為0、400 μmol/mL 的CoCl2子溶液，每組培養(yǎng)24、48、72 h 后，在酶標(biāo)儀上（OD450 nm 處）測(cè)定各孔吸光度（OD）值，再計(jì)算細(xì)胞活力值。細(xì)胞活力值（%）=（OD 值各加藥組-OD 值空白組）/（OD 值不加藥組-OD 值空白組）×100%。

1.2.2 EPO 對(duì)缺氧情況下U251 細(xì)胞增殖的影響

將細(xì)胞分為CoCl2組和CoCl2+EPO 組，加入不同濃度的EPO（EPO 濃度分別為0、75 U/mL）。每組培養(yǎng)24、48 h后，在酶標(biāo)儀上（450 nm 處）測(cè)定各孔值，再計(jì)算細(xì)胞活力值，方法同上。

1.2.3 qPCR 法檢測(cè)CoCl2組和CoCl2+EPO 組BMI1基因的轉(zhuǎn)錄水平

1.2.3.1 提取CoCl2組和CoCl2+EPO 組的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作?；靹螂x心，在42℃15 min，98℃5 min 條件下作用20 min后，放入-20℃存放。見(jiàn)表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（μL）

1.2.3.2 qPCR 實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所用到基因的引物均由上海生工生物有限公司合成，將收到后的引物瞬時(shí)離心，然后加入10 倍體積的滅菌水稀釋?zhuān)镄蛄?。并配制PCR 的體系，在冰盒上操作。見(jiàn)表2～3。將配好的反應(yīng)體系置于PCR 儀內(nèi)反應(yīng)，將反應(yīng)條件設(shè)為：Holding Stage：95℃，1 min 1 個(gè)循環(huán)；Cycling Stage：95℃15 s、60℃15 s、72℃45 s 共39 個(gè)循環(huán)反應(yīng)；Melt Curve Stage：65℃5 s、95℃50 s 1 個(gè)循環(huán)。

表2 引物序列

表3 PCR 反應(yīng)體系（μL）

1.2.3.3 計(jì)算RQ 值。RQ 值表示某一基因在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)差異倍數(shù)，各組目的基因的Ct 值減內(nèi)參基因的Ct 值為△Ct，然后用各實(shí)驗(yàn)組△Ct 減去對(duì)照組△Ct 算出△△Ct 值，RQ=2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 測(cè)定CoCl2對(duì)U251 細(xì)胞增殖的影響

CoCl2組U251 細(xì)胞48、72 h 時(shí)OD 值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同濃度CoCl2處理的細(xì)胞在培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)的OD 值（）

表4 不同濃度CoCl2處理的細(xì)胞在培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)的OD 值（）

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P ＜0.05

2.2 CCK-8 測(cè)定EPO 對(duì)缺氧情況下U251 細(xì)胞增殖能力的影響

CoCl2+EPO 組U251 細(xì)胞24 h 的OD 值為（1.257±0.035），48 h 的OD 值為（1.31±0.081）。與CoCl2組24、48 h 時(shí)OD 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.3 qPCR 法檢測(cè)CoCl2組和CoCl2+EPO 組BMI1基因的轉(zhuǎn)錄水平

熔解曲線與熔解峰單一，提示擴(kuò)增產(chǎn)物單一無(wú)非特異性產(chǎn)物，見(jiàn)圖1。以CoCl2組BMI1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量RQ 值為1，CoCl2+EPO 組RQ 值為（2.013±0.269）。CoCl2+EPO 組表達(dá)量高于CoCl2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 BMI1 PCR 擴(kuò)增圖

圖2 BMI1 PCR 熔解峰圖

3 討論

新生兒缺血缺氧性腦病（HIE）指圍生期宮內(nèi)窘迫、產(chǎn)期窒息，導(dǎo)致腦組織中樞神經(jīng)缺氧缺血而受損害，是新生兒窒息的重要并發(fā)癥，臨床上發(fā)病率和死亡率均較高，是造成兒童殘疾最常見(jiàn)的原因之一，進(jìn)行早期干預(yù)是防治HIE 神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的有效方法。Lan 等[13]發(fā)現(xiàn)用EPO 治療海馬損傷模型的新生大鼠后，顯著改善了神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，避免了海馬損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，提示EPO可能是治療缺氧缺血誘導(dǎo)的新生兒腦損傷的有效方法。因此本實(shí)驗(yàn)使用CoCl2建立體外細(xì)胞缺氧模型來(lái)模擬新生兒缺氧時(shí)腦內(nèi)低氧環(huán)境，研究EPO 對(duì)缺氧環(huán)境下神經(jīng)膠質(zhì)U251 細(xì)胞的保護(hù)作用。

CoCl2作為化學(xué)低氧誘導(dǎo)劑常常被用來(lái)制造缺氧模型，具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α 和模擬缺氧的作用。CoCl2能夠在鐵的結(jié)合中心用鈷代替鐵的脯氨酰羥化酶來(lái)降低羥化活性，促進(jìn)HIF-1α 的生成進(jìn)而模擬體內(nèi)缺氧微環(huán)境[14-15]。Zhang 等[16]應(yīng)用CoCl2構(gòu)建體外乳腺癌細(xì)胞的缺氧模型，發(fā)現(xiàn)CoCl2通過(guò)促進(jìn)HIF-1α 的表達(dá)，來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和參考文獻(xiàn)，將作用細(xì)胞的CoCl2濃度分為0 μmol/mL和400 μmol/mL，分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48 h 和72 h 后，運(yùn)用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251 細(xì)胞的增殖情況。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)CoCl2濃度400 μmol/mL 時(shí)能夠抑制U251 細(xì)胞的增殖能力，提示缺氧模型構(gòu)建成功。

EPO 是由多肽和糖基構(gòu)成，是一種單鏈的酸性糖蛋白。EPO 發(fā)揮生理作用時(shí)需要與EPOR 結(jié)合，通過(guò)JAK2 及其他信號(hào)通路促進(jìn)紅細(xì)胞與血管生成和作用于紅系祖細(xì)胞增殖、分化和成熟等。EPO 和EPOR 在人類(lèi)、嚙齒類(lèi)動(dòng)物的大腦中廣泛分布。Traudt 等[17]發(fā)現(xiàn)，EPO 對(duì)缺氧缺血引起的腦損傷能有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)將一定濃度EPO 加入到U251 細(xì)胞CoCl2缺氧模型中培養(yǎng)細(xì)胞，并采用CCK-8 法檢測(cè)。結(jié)果顯示，75 U/mL 的EPO 能夠促進(jìn)缺氧條件下U251 細(xì)胞的增殖，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

BMI1 基因由9 個(gè)外顯子和9 個(gè)內(nèi)含子組成，是多梳基因家族（PcG）的重要成員之一。在體內(nèi)通過(guò)與c-myc 蛋白共同作用，抑制INK4a 位點(diǎn)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖[18]。BMI1 基因在胃腸道間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)增加，表達(dá)量與胃腸道間質(zhì)瘤的危險(xiǎn)度分級(jí)相關(guān)，增殖基因Cyclin Dl 的表達(dá)，抑制凋亡基因caspase-7 的表達(dá)[19]。BMI1 基因與位于中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新密切相關(guān)。BMI1 基因缺陷的神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力下降，神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制基因p16Ink4a 上調(diào)，神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度下降，同時(shí)細(xì)胞數(shù)量也隨時(shí)間逐漸下降。干擾p16Ink4a 基因的表達(dá)，使神經(jīng)干細(xì)胞重新獲得自我更新能力。這些發(fā)現(xiàn)提示，BMI1 基因能夠抑制p16Ink4a基因，提高神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力[20]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧條件下EPO 能夠提高U251 細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)BMI1 的表達(dá)，提示EPO 可能通過(guò)上調(diào)BMI1 的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究使用CoCl2成功構(gòu)建U251 細(xì)胞缺氧模型，外源性給予EPO 處理缺氧環(huán)境下的U251 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EPO 可以促進(jìn)缺氧環(huán)境下神經(jīng)膠質(zhì)U251 細(xì)胞的增殖，并且可以上調(diào)BMI1 的轉(zhuǎn)錄水平。提示EPO 可能通過(guò)上調(diào)BMI1 的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。此外，進(jìn)一步闡明EPO 對(duì)缺氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為EPO 在HIE 治療中的作用提供有意義的分子基礎(chǔ)機(jī)制，為治療HIE 提供新思路。