高效液相色譜法測定肉桂醛生物轉化體系中10種苯基香料

黃秋容，粟桂嬌，梁敏，王一凡，于唱，馬麗，*

（1.廣西大學化學化工學院，廣西南寧530004；2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530004）

肉桂醛是我國重要林產資源——肉桂油的主要成分（約占75%～90%）[1-2]。目前我國產的肉桂油主要是以初級香料原料出口到國外[3]，價格低廉，導致桂油相關產業(yè)的經濟效益和社會效益低下。利用肉桂醛開發(fā)高附加值的系列新產品可帶動肉桂油相關產業(yè)的技術升級，意義重大。利用微生物轉化制備的香精香料可視為“天然品”[4-5]，附加值大大提高，是國內外研究的熱點[6-7]。目前能運用微生物發(fā)酵工程制備的天然香料主要有天然乙偶姻[8]、天然香蘭素[9]和天然苯乙醇[10]等。關于以肉桂醛為底物通過微生物轉化合成天然苯基香精香料的研究較少。為了提高桂油相關產業(yè)的經濟效益，利用生物轉化技術將肉桂醛進一步轉化成更高價值的天然苯基香精香料是一個重要途徑。實現(xiàn)這一目標的關鍵在于篩選出耐受、高效轉化肉桂醛的菌株。由于微生物種類的多樣性，篩菌工作量十分龐大而且微生物轉化肉桂醛體系成分十分復雜，如圖1所示。Pennacchio 等[11]利用大腸桿菌選擇性加氫還原肉桂醛合成肉桂醇；Velasco 等[12]利用真菌Aspergillus sp.生物轉化反式肉桂醛，代謝產物主要有肉桂醇、3-苯丙醇、芐醇、1-苯乙醇和 2-苯乙醇；劉斌[13]、張笮晦[14]分別利用從肉桂皮和土壤中分離得到的細菌生物轉化肉桂醛合成肉桂醇。為了快速篩選出高效轉化肉桂醛的目的菌株并確定其生物轉化產物，需要建立一種同時測定肉桂醛生物轉化體系中可能產物的分析方法。

圖1 肉桂醛生物轉化體系成分關系流程圖Fig.1 The flow chart of composition relationships of cinnamaldehyde biotransformation system

目前關于肉桂醛生物轉化體系中各物質的分析方法主要有氣相色譜法[15-18]、高效液相色譜法[19-22]和紫外-可見分光光度法[23-24]等。這些方法大多只能測定其中的3 種～5 種化合物，能同時檢測10 個組分的分析方法未見報道。因此，亟待建立一種同時測定肉桂醛生物轉化體系中10 種天然苯基香精香料的分析方法，不僅可用于微生物轉化肉桂醛合成天然苯基香料的生物反應體系的成分分析，還能用于高效轉化肉桂醛合成高價值天然苯基香精香料菌株的快速篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695（Separations Module）高效液相色譜儀（配 2489 UV-VIS 檢測器）、SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國 Waters 公司；Microfuge 22R 臺式微量離心機：德國Beckman Coulter 公司；BSA224S 電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；；Agilent 8453E 紫外可見分光光度計：美國安捷倫公司；SB25-12YDTD 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

肉桂醛（AR，98 %）、肉桂醇（AR，98 %）、苯甲醛（AR，＞98.5%）、苯甲酸（AR，＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；肉桂酸（AR，98%）：上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；苯甲醇（AR，99%）：阿達瑪斯試劑有限公司；苯乙醇（AR，97%）：美國 Acros Organics 公司；苯乙酮（GC，＞99.0%）：上海阿拉丁科技股份有限公司；3-苯丙醇（AR，98%）：上海源葉生物科技有限公司；3-苯丙醛（AR，95%）：國藥集團化學試劑有限公司。甲醇、乙腈（均為色譜級）：德國默克公司；冰醋酸（色譜級）：天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸（AR，＞85%）：成都金山化學試劑有限公司。試驗所用水均為超純水。

1.2 標準溶液的配制

混合標準儲備液（1.000 g/L）：分別準確稱取10 種香精香料標準品適量，用無水乙醇溶解配成2.000 g/L的單組分標準儲備液；然后分別移取適量體積的各單組分標準儲備液于棕色容量瓶，用無水乙醇/基質溶液（體積比1 ∶1）定容得到1.000 g/L 的混合標準儲備液。

混合標準工作液：準確吸取適量的混合標準儲備液經無水乙醇稀釋后得到質量濃度范圍為2.00 mg/L～318.60 mg/L 的一系列混合標準工作液。

1.3 樣品的制備

將肉桂醛生物轉化液加入等體積的無水乙醇，振蕩搖勻，靜置5 min 后用移液槍吸取2 mL 液體于2 mL EP 管，離心（12 000 r/min，5 min，25 ℃），準確吸取 1 mL上清液于10 mL 棕色容量瓶，用無水乙醇定容后，再用一次性無菌注射器吸取1 mL 樣液過0.22 μm 有機濾膜待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：（30±5）℃；流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=28.4 ∶18 ∶53.6 ∶0.04（體積比）；等梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；檢測器：UV-VIS 紫外檢測器，檢測波長：204 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

2.1 樣品提取方式的選擇

考察了超聲提取、振蕩提取2 種常見提取方式對微生物轉化肉桂醛體系中各組分的提取效率的影響。取同一批次的轉化液共6 份，加等量無水乙醇后，加入一定量的混合標準工作液，取其中3 份振蕩提取3 min；另外3 份超聲提取3 min（超聲頻率40 Hz，功率30%，溫度25 ℃），靜置5 min 后用移液槍吸取2 mL液體于 2 mL EP 管，離心（12 000 r/min，5 min，25 ℃），準確吸取1 mL 上清液于10 mL 棕色容量瓶，用無水乙醇定容，過膜，經高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析后，計算加標回收率。結果表明，超聲提取和振蕩提取兩種提取方式對微生物轉化肉桂醛體系中各物質的提取效率無明顯差異。為試驗方便，選擇振蕩提取方式。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

分別取“1.2”節(jié)所配置的單組分標準儲備液適量，用無水乙醇稀釋成質量濃度為10 mg/L 的10 種物質單標液，以無水乙醇為空白液，通過紫外分光光度計于200 nm～400 nm 波長范圍內進行全波長掃描，得各組分紫外吸收光譜圖，見圖2。

如圖2 所示，微生物轉化肉桂醛體系中的10 種目標待測物的最大紫外吸收峰在204 nm～272 nm 之間。為兼顧各化合物的檢測靈敏度，本試驗選擇204 nm 作為檢測波長。

2.2.2 流動相的選擇

圖2 10 組分紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of ten components

流動相組成和配比是高效液相色譜分離的重要影響因素之一?？疾炝思状?、乙腈和純水對生物轉化肉桂醛體系中10 種物質的色譜分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，3 種試劑無論是單獨或者兩兩組合用作流動相均不能將體系中的10 種物質完全有效分離；當流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水=28.4 ∶18 ∶53.6（體積比）時，各組分能實現(xiàn)有效分離。

在探究流動相比例的過程中，較高濃度時肉桂酸峰型較寬且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這可能是肉桂酸分子離子化造成的。加酸可抑制酸的電離。試驗比較了在純水中加入0.04%磷酸和0.04%冰醋酸對改善肉桂酸峰型的效果。結果表明，在純水中加入0.04%的冰醋酸后，肉桂酸檢測靈敏度提高，峰型變窄，拖尾現(xiàn)象減輕，且對其他組分無影響。因此，最終選擇流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=28.4 ∶18 ∶53.6 ∶0.04（體積比）。此條件下10 種目標待測物在20 min 內全部出峰，且分離效果良好，標準圖譜見圖3。

圖3 10 組分混標液（100 mg/L）HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of ten components mixed standard solution

2.3 分析方法評價

2.3.1 基質效應

基質效應（matrix effects，ME）是指除目標測定物以外的其余組分對測定結果影響，即基質對分析方法準確性的干擾，主要表現(xiàn)為基質增強和基質抑制[25-27]。微生物轉化肉桂醛體系中的10 種物質均為帶苯環(huán)的芳香族化合物，幾乎不溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑。微生物轉化肉桂醛轉化液有培養(yǎng)基、底物及轉化產物等物質，屬于非均向、多組分混合體系。參照“1.3”方法，用培養(yǎng)基溶液代替轉化液進行預處理，制備空白基質溶液。分別在純溶劑和空白基質溶液加入一定量的混合標準儲備液，配制濃度相同的兩種檢測液，同等色譜條件下檢測，根據(jù)兩種檢測液色譜響應值考察微生物轉化肉桂醛體系的基質效應，計算公式[28-30]如下：

式中：Mi為基質溶液中目標測定物的基質效應；Ami為基質溶液中目標測定物的色譜峰面積；Asi為純溶劑中目標測定物的色譜峰面積。當|Mi|≤20%時，可忽略而無需采取補償措施；20%≤|Mi|≤50%為中等基質效應；|Mi|＞50%為強基質效應，需采取措施補償基質效應。微生物轉化肉桂醛體系中各組分的基質效應見表1。

表1 微生物轉化肉桂醛體系中各組分的基質效應Table 1 Matrix effect of components in microbial transformation of cinnamaldehyde system

由表1 可知，苯乙醇、肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸基質效應小于20%；苯甲醛、苯甲酸基質效應大于50%，其他組分均為中等基質效應。采用基質匹配標準溶液作標準曲線可抵消基質效應對測定的影響，所以本試驗采用無水乙醇/基質溶液來配制混合標準工作液制作標準曲線。

2.3.2 線性范圍與檢出限

在質量濃度為2.00 mg/L～318.60 mg/L 的10 種標準物質的混合標準工作液，在優(yōu)化的條件下進行檢測，以各目標測定物的峰面積（y）為縱坐標，標準溶液質量濃度為橫坐標（x，mg/L），外標法定量，得到各目標測定物的線性回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限。以信噪比（S/N）=3 計算儀器檢出限（LOD，mg/L），各數(shù)據(jù)見列表2。

2.3.3 加標回收率試驗與精密度試驗

取已知含量的樣品溶液，加入低、中、高3 組濃度梯度的標準品溶液，每組試驗在優(yōu)化條件下平行測6 次，計算回收率和相對標準偏差，結果見表3。

表2 10 種香精香料的線性回歸方程、相關系數(shù)及檢出限Table 2 Linear relationship，correlation coefficient and limit of detection of ten flavors

表3 10 種香精香料的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recovery rate and relative standard deviation of ten flavors（n=6）

續(xù)表3 10 種香精香料的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Continue table 3 Recovery rate and relative standard deviation of ten flavors（n=6）

結果表明，微生物轉化肉桂醛體系中各目標化合物的回收率為92.13 %～102.90 %，RSD 為0.62 %～4.01%。說明該方法準確度高，精密度好，滿足微生物轉化肉桂醛體系中各目標化合物的測定要求。

2.4 樣品的測定

隨機選取5 組不同批次的轉化液，按“1.3”中方法處理，在優(yōu)化的色譜條件下進行測定，觀察各物質峰型、保留時間，計算相對平均偏差（n=5）。測定結果表明，不同批次轉化液中各物質峰型對稱，無疊峰、拖尾現(xiàn)象，保留時間基本一致，RSD 均小于5%，說明該分析方法對肉桂醛生物轉化體系中各物質具有良好的定性定量效果。

2.5 方法的應用

為了驗證方法的實用性，用從肉桂新鮮枝葉中篩選分離得到的內生菌來轉化肉桂醛，轉化液用該分析方法進行高效液相色譜分析，篩選出若干能高效轉化肉桂醛為肉桂醇的菌株，其轉化液色譜圖如圖4。

圖4 轉化液HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of a conversion solution

底物肉桂醛峰消失，新出現(xiàn)的峰比照10 組分混標樣譜圖為肉桂醇物質峰。峰型對稱，保留時間穩(wěn)定，表明該分析方法適用于生物轉化肉桂醛體系中產物的定性定量。

3 結論

本文建立一種同時測定肉桂醛生物轉化體系中10 種香精香料的高效液相色譜分析方法。10 種物質在20 min 內全部出峰，且峰型良好，各目標測定物在2.00 mg/L～318.60 mg/L 范圍內線性關系良好（0.998 7≤R2≤0.999 6），方法檢出限（LOD，S/N=3）為 0.36 mg/L～1.16 mg/L，在低、中、高3 個加標水平下的平均回收率為92.13 %～102.90 %，RSD 為0.62 %～4.01 %。該方法具有方便快速、靈敏度高、準確性高的特點，滿足肉桂醛生物轉化體系中的成分測定要求，特別適用于以肉桂醛為底物生物合成各種香精香料的篩菌工作。