在線凈化-液相色譜法快速測定熏烤水產(chǎn)品中的苯并（a）芘

章驊，陳旭艷，張靚文

（天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津300461）

苯并（a）芘[benzo（a）pyrene，BaP]，屬于多環(huán)芳烴類。1933 年，英國學(xué)者從煤焦油中分離出苯并芘，并誘發(fā)了小鼠皮膚癌，使BaP 成為第一個被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物，且致癌性很強，是世界公認的三大致癌物之一，BaP 可引發(fā)皮膚、肺、食道等部位的腫瘤和癌變[1-2]，同時還具有致畸性和致突變性，能通過母體經(jīng)胎盤影響子代，從而引起胚胎畸形或死亡以及免疫功能下降[3-4]。熏烤魚及其制品在熏烤過程中可以產(chǎn)生酚類、有機酸和內(nèi)脂等活性物質(zhì)，帶來獨特的風(fēng)味、色澤和芳香，深受消費者的喜愛[5]。但是，熏烤過程中木炭等燃料的不完全燃燒和脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物等有機物的熱解會產(chǎn)生副產(chǎn)物多環(huán)芳烴（polycyclic aromativ hydrocarbons，PAHs），其中毒性最大的當(dāng)屬 BaP。又因其親脂性，BaP 易積蓄在脂肪組織內(nèi)[6-7]。因此，檢測此類食品中BaP 的含量顯得尤為重要。我國GB 2762-2017 《食品安全國家標(biāo)準食品中污染物限量》[8]規(guī)定熏、烤水產(chǎn)品中BaP 的限量為5.0 μg/kg。歐盟法規(guī)No 835/2011《食品中多環(huán)芳烴限量》規(guī)定熏烤魚及其魚制品的肌肉部分中BaP 的含量要≤2 μg/kg。

國內(nèi)外不少研究已經(jīng)建立了BaP 的檢測方法，主要采用薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[9-11]。經(jīng)過多次的修訂，現(xiàn)行國家標(biāo)準GB 5009.27-2016 《食品安全國家標(biāo)準食品中苯并（a）芘的測定》[12]廢止了部分較陳舊的檢測方法，采用液相色譜-熒光檢測器法測定。該標(biāo)準用正己烷提取熏烤水產(chǎn)品中的BaP，用中性氧化鋁柱或分子印跡柱進行富集凈化，操作繁瑣費時，溶劑毒性大，尤其是中性氧化鋁柱活度難以控制，回收率不穩(wěn)定。而大量使用有機溶劑，如果試劑不純有BaP 殘留，洗脫后經(jīng)濃縮而被富集，易出現(xiàn)假陽性情況。

針對上述問題，本研究基于GB 5009.27-2016《食品安全國家標(biāo)準食品中苯并（a）芘的測定》，對檢測方法進行了優(yōu)化，通過在線固相萃取對熏烤魚樣品進行凈化，建立了在線凈化-液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BaP 標(biāo)準溶液：德國 Dr.Ehrenstorfer 公司，1 000 mg/L；乙腈：色譜純，德國Merck 公司；乙酸乙酯、異丙醇：均為色譜純，Dikma 公司；無水硫酸鈉：分析純，天津市佑潔化工貿(mào)易有限公司；Acclaim C8（4.6 mm×10 mm，5 μm）：美國 Thermofisher 公司；Ultimate PAH（4.6 mm×250 mm，5 μm）：Welch 公司；所有試驗用水均為去離子水（經(jīng)Millipore 純水系統(tǒng)純化，電阻＞18.2 MΩ）；烤魚片：市售。

U-3000 液相色譜儀（配有3000 型紫外檢測器，3100 型熒光檢測器）：美國 Thermofisher 公司，3100 型熒光檢測器；Mili-Q 型純水儀：美國Millipore 公司；IKA T18 型高速均質(zhì)器、IKA HS 501digital 型平板振蕩器：德國IKA 公司；ME 204 型分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

在線凈化柱：Acclaim C8（4.6 mm×10 mm，5 μm）；分析柱：Ultimate PAH（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；熒光檢測器參數(shù)：激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm；進樣量 100 μL；分析柱流動相：A 為乙腈，B 為水，乙腈-水（體積比 80 ∶20）等度洗脫，流速1.2 mL/min，凈化柱流動相：A 為乙腈，B 為水，C 為乙酸乙酯，流速1.0 mL/min。凈化柱流動相梯度洗脫條件及切換閥位置見表1。

表1 凈化柱流動相梯度洗脫條件及切換閥位置Table 1 The mobile phase gradient elution condition of the clean up column and the position of the switching

1.2.2 試驗方法

稱取2.00g（精確至0.001g）樣品于50mL 離心管中，加入無水硫酸鈉2.0 g 和20 mL 乙酸乙酯以20 000 r/min高速均質(zhì)2 min，8 000 r/min 離心 10 min，過 0.45 μm有機濾膜后，供液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 在線凈化柱的選擇

對于BaP 標(biāo)準溶液，常規(guī)的C8、C18柱和Chrom－Spher Pi 柱都可實現(xiàn)在線富集的作用。但原理并不相同。ChromSpher Pi 利用供體與受體結(jié)合的原理，作為π 電子供體的BaP 與π 電子受體的固定相結(jié)合而別保留在凈化柱上。C8和C18是疏水性最強的硅膠基體吸附劑，對非極性化合物都有較強的保留能力，使用較為廣泛。苯并芘為弱極性物質(zhì)，因此都可被二者保留。ChromSpher Pi 柱售價較高，因此本試驗對比了相對低價的C8柱和C18柱。C18對極性弱的物質(zhì)的保留能力強，而C8的碳鏈較短，保留能力相對弱，所以樣品中油脂在C18柱保留較強不能完全排出，在流路切換后有可能將油脂帶入分析柱，進而污染分析柱。因此，本試驗選擇C8柱作為在線凈化柱，樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后上樣，隨乙腈-水（體積比80 ∶20）進入凈化柱，此時C8柱對BaP 沒有保留，油脂類基質(zhì)被保留，BaP 直接進入分析柱進分析。BaP 完成轉(zhuǎn)移后，切換閥切換回初始狀態(tài)，利用乙酸乙酯對凈化柱進行梯度洗脫，將高保留的油脂成分快速洗脫，同時活化凈化柱。

2.2 提取溶劑的選擇

分別采用乙腈、異丙醇、乙酸乙酯、正己烷對樣品進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈、異丙醇提取效率較低（回收率僅50%）；正己烷極性太小，制得的樣品溶液油脂含量較大，可能導(dǎo)致固相萃取柱過載，且正己烷揮發(fā)性過強，可能影響進樣精密度；而采用乙酸乙酯屬中等極性，提取效率和回收率相對較好，能夠保證BaP 的提取，同時帶入雜質(zhì)較少，可減少不同樣品間干擾；加入無水硫酸鈉可對樣品溶液進行脫水處理，進一步減少干擾，避免乳化現(xiàn)象的發(fā)生。

2.3 進樣量的確定

本試驗為了減少前處理步驟，縮短操作時間，沒有對樣品提取液進行濃縮處理，采用提取液直接進樣/在線前處理的方式分析。樣品經(jīng)過提取被稀釋了10倍，為了得到與GB5009.27-2016 《食品安全國家標(biāo)準食品中苯并（a）芘的測定》相當(dāng)?shù)撵`敏度，將進樣量擴大了5 倍，為100 μL。經(jīng)測試方法靈敏度可滿足檢測要求，BaP 標(biāo)準色譜圖見圖1。

圖1 BaP 的標(biāo)準色譜圖Fig.1 Chromatogram of BaP

2.4 線性方程和方法檢出限

按照GB5009.27-2016《食品安全國家標(biāo)準食品中苯并（a）芘的測定》配制 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的校準曲線溶液，稀釋10 倍后進樣，得到校準曲線的線性方程為Y=29 928.133 0X-5.198 0，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，BaP 校正曲線見圖2。

圖2 苯并（a）芘的校準曲線Fig.2 Standard curve of BaP

結(jié)果表明，BaP 在 0.5 ng/mL～20.0 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍與峰面積具有良好的線性關(guān)系。以峰面積為基線噪聲的3 倍濃度推算方法的檢出限，BaP 的檢出限為0.035 ng/mL。

2.5 方法的重復(fù)性和回收率

選取烤魚空白樣品，進行 0.5、5.0 μg/kg 和 10.0 μg/kg 3 個水平添加BaP 回收試樣，每個水平重復(fù)測定6 次，計算回收率和相對標(biāo)準偏差，回收率為89.6%～99.0%，相對標(biāo)準偏差為1.3%～3.1%。具體見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery of BaP

烤魚樣品空白色譜圖見圖3，烤魚空白樣品添加 5.0 μg/kg 水平BaP 色譜圖見圖4。

圖3 烤魚空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample

圖4 烤魚空白樣品加標(biāo)5.0 μg/kg 色譜圖Fig.4 Chromatogram of blank sample with 5.0 μg/kg BaP standard solution

3 結(jié)論

本試驗采用在線固相萃取技術(shù)建立熏烤水產(chǎn)中的BaP 含量的測定方法。只需對樣品進行簡單的提取后，即可上機進樣分析。減少有機試劑和耗材的使用量，無需人工操作，避免了人為誤差，省時省力，重現(xiàn)性好，回收率穩(wěn)定。本方法平均回收率為89.6%～99.0%，相對標(biāo)準偏差為1.3%～3.1%。適用于大量熏烤水產(chǎn)品樣品的快速檢測。