蛹蟲草多糖的提取及對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

李志濤，孫金旭，劉海鵬，王青華，張志強(qiáng)，高越，王暉

（1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000；2.衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河北衡水053000）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草，是一種藥食兩用的真菌，其含有多種生物活性物質(zhì)，醫(yī)療保健功能很高，其中，蛹蟲草多糖是其最重要的生物活性成分之一[1-4]。目前，多糖提取的傳統(tǒng)方法多為熱水提取法，這種方法存在費(fèi)時長、提取率低等問題，超聲波提取可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有助于多糖的溶出，可以明顯縮短提取時間，提高多糖的提取率，微波提取方法簡單且多糖的提取率相對較高，超聲和微波提取法相比傳統(tǒng)提取方法優(yōu)勢明顯[5-10]，但多糖提取率仍不夠理想，目前，單獨(dú)采用微波法或超聲法提取蛹蟲草菌絲體多糖的報道很多，但將微波提取法和超聲提取法結(jié)合起來提取蛹蟲草菌絲體多糖的報道很少見，因此，本研究采用微波法和超聲波法協(xié)同提取蛹蟲草多糖，優(yōu)化蛹蟲草多糖的最佳提取工藝，旨在最大限度的提高蛹蟲草多糖的提取率，并研究提取到的蛹蟲草多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步研究蛹蟲草多糖的免疫活性和開發(fā)蛹蟲草資源提供技術(shù)參數(shù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌絲體：衡水學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。60 ℃下恒溫烘干。

葡萄糖：泰州市興華化學(xué)品公司；無水乙醇：天津市金衛(wèi)爾化工公司；RPMI-1640 不完全培養(yǎng)液：Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺：上海璽恒實(shí)業(yè)有限公司；KS16000G 型臺式高速離心機(jī)：上海冠森生物科技有限公司；EL-320 型電子天平：常州市天之平儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波-微波協(xié)同法提取蛹蟲草多糖

1.3.1.1 提取工藝[11-13]

蛹蟲草→粉碎→加蒸餾水浸泡→置于超聲-微波協(xié)同反應(yīng)儀→超聲波提?。ü潭ㄎ⒉üβ剩x心得上清液→濃縮→加入乙醇沉淀→靜置→離心得沉淀→無水乙醇、丙酮分別洗滌→低溫干燥→蛹蟲草多糖

1.3.1.2 蛹蟲草多糖的測定[14]

利用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定多糖，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。把葡萄糖的毫克數(shù)作為橫坐標(biāo)，吸光度值（波長490 nm）作為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=6.718 8X，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。隨后測定出多糖樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計算出試驗(yàn)樣品中多糖的含量。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

1）最佳物料粒度的確定

圖1 苯酚-硫酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenol-vitriol

設(shè)置料液比1∶30（g/mL），固定微波功率為400 W，超聲波功率為200 W，超聲波時間35 min，提取溫度60 ℃，超聲波提取 1 次，乙醇和濃縮液之比 3 ∶1（體積比）。將粉碎后的蛹蟲草菌體粉末分別通過孔徑為0.106 mm（140 目）、0.125 mm（120 目）、0.150 mm（100 目）、0.180 mm（80目）、0.250 mm（60 目）的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，按照多糖提取工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)，探究物料粒度對多糖提取率的影響，進(jìn)而確定最佳的物料粒度[15]。

2）最適料液比的確定

采用得到的最佳物料粒度，固定微波功率為400 W，超聲波功率200 W，超聲波提取時間35 min，提取溫度為 60 ℃，提取次數(shù) 1 次，乙醇和濃縮液之比 3 ∶1（體積比）。調(diào)節(jié)料液比分別為 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），按多糖提取工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)，探索料液比對多糖提取率的影響，進(jìn)而確定合適的料液比。

3）最佳超聲波功率的確定

采用得到的最佳物料粒度和料液比，固定微波功率為400 W，超聲波時間為35 min，提取溫度60 ℃，提取次數(shù)設(shè)為1 次，乙醇和濃縮液之比3 ∶1（體積比）。設(shè)置超聲波功率分別為 100、200、300、400、500 W，按照多糖提取工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)，探究超聲波功率對多糖提取率的影響，進(jìn)而確定出最佳的超聲波功率。

4）最佳超聲時間的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率和料液比，固定微波功率為400 W，提取溫度調(diào)節(jié)到60 ℃，提取次數(shù)設(shè)定在1 次，乙醇和濃縮液之比3 ∶1（體積比）。調(diào)節(jié)超聲波時間分別為 20、25、30、35、40 min，依照多糖的提取工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)操作，分析超聲波提取時間的改變對多糖提取率的影響，進(jìn)而確定最佳的超聲波時間。

5)最適提取溫度的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率、超聲波時間和料液比，固定微波功率為400 W，提取次數(shù)1 次，乙醇和濃縮液之比在3 ∶1（體積比）。設(shè)定提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃，按照多糖提取工藝流程完成試驗(yàn)操作，研究提取溫度對多糖提取率的影響，進(jìn)而得到合適的提取溫度。

6）最適超聲提取次數(shù)的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率、超聲波時間、提取溫度和料液比，固定微波功率為400 W，乙醇和濃縮液之比在3 ∶1（體積比）。超聲波提取次數(shù)分別為 1 次、2 次、3 次、4 次、5 次，按多糖提取工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)，研究超聲波提取次數(shù)對多糖提取率的影響，進(jìn)而確定合適的超聲波提取次數(shù)。

7）最佳乙醇與濃縮液之比的確定

采用得到的最佳物料粒度、超聲波功率、超聲波時間、提取溫度、超聲波提取次數(shù)和料液比，固定微波功率為400 W。調(diào)節(jié)乙醇與濃縮液之比（體積比）分別為 1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1，按照多糖提取工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)操作，研究分析乙醇與濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響，進(jìn)而確定出最佳的乙醇與濃縮液之比。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

固定微波功率為400 W，選取7 個影響蛹蟲草多糖提取效果的主要因素，即物料粒度、料液比、超聲波功率、超聲波時間、提取次數(shù)、提取溫度、乙醇與濃縮液之比，進(jìn)行七因素三水平的正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2.3 蛹蟲草多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響[14]

頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取脾，磨碎，過不銹鋼篩網(wǎng)，在1 000 r/min 條件下離心10 min，收集脾細(xì)胞，然后RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）不完全培養(yǎng)液洗滌，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)（臺盼藍(lán)染色法），用RPMI-1640 完全培養(yǎng)液（含10%的小牛血清）進(jìn)行調(diào)整，使細(xì)胞密度達(dá)到 2×106（個/mL），制備成脾細(xì)胞懸液。于96 孔酶標(biāo)板中加入100 μL 細(xì)胞懸液（每孔都加）。陰性對照：再加完全培養(yǎng)液20 μL；陽性對照：Con A（刀豆蛋白A）和完全培養(yǎng)液各加10 μL；試驗(yàn)組：Con A（刀豆蛋白A）和樣品溶液各加10 μL。其中，陰性對照、陽性對照和試驗(yàn)孔，各設(shè)置3 個重復(fù)孔。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2飽和濕度培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中培養(yǎng)。培養(yǎng)至 66 h 后加 10 μL 無菌噻唑藍(lán)（5 mg/mL，每孔都加）。培養(yǎng)至72 小時后，加入十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，10%的SDS，每孔都加）終止反應(yīng)，測定OD490nm值。結(jié)果以刺激指數(shù)（stimulate index，SI）來表示，SI 值大于 1 時，多糖樣品對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用（反之則具有抑制作用），SI 值越高，表示多糖樣品對小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用越大，即免疫調(diào)節(jié)活性越大[16]。

樣品溶液：取蛹蟲草多糖樣品，配制成3 組不同劑量的溶液，分別為低劑量組（0.5 mg/mL）、中劑量組（1.0 mg/mL）和高劑量組（2.0 mg/mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 物料粒度對多糖提取率的影響

物料粒度對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖2。

圖2 物料粒度對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.2 The material size influencing for extractionrate of polysaccharide from Cordyceps militaris

物料粒度的大小將影響最終的多糖提取率，物料粒度越小即粉末越細(xì)時，菌絲體被充分粉碎，致使菌體中更多的多糖從中溶解出來，那么多糖的提取率也會相應(yīng)升高，但是如果物料粒度太小，在提取過程中會出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象，所以提取率又會有所下降。由圖2看出，物料粒度在0.150 mm 時提取率最高，蛹蟲草多糖提取率為5.09%。所以后續(xù)單因素試驗(yàn)均采用物料粒度為0.150 mm。

2.1.2 料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響

料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖3。

圖3 料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.3 The ratio of material to liquid influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

在提取的過程中的加水量將對多糖的提取率產(chǎn)生影響，伴隨著試驗(yàn)中加水量的增加，多糖溶出越充分，多糖的提取率變大，但過多的加水量又會降低提取率，可能是由于超聲波破碎細(xì)胞的阻力變大，提取率降低。由圖3 可知，料液比為1 ∶40（g/mL）時多糖提取率最高，蛹蟲草多糖提取率為5.20%。所以后續(xù)單因素試驗(yàn)采用料液比 1 ∶40（g/mL）。

2.1.3 超聲波功率對蛹蟲草多糖提取率的影響

超聲波功率對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖4。

圖4 超聲功率對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.4 The ultrasonic power influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

由圖4 可知，在一定范圍內(nèi)超聲波功率與多糖提取率成正比，在功率300 W 時達(dá)到最大值，之后提取率又會顯現(xiàn)出有所降低，這主要是因?yàn)楣β势蜁r，超聲波空化作用偏小，進(jìn)而提取率偏低，反之，提取率增大，但是如果超功率過大，反而會使溶劑中出現(xiàn)較多的空化氣泡，其產(chǎn)生的阻礙作用會降低多糖的提取率。超聲波功率在300 W 時多糖提取率最高，蛹蟲草多糖提取率為5.41%。所以后續(xù)單因素試驗(yàn)采用功率300 W。

2.1.4 超聲波時間對蛹蟲草多糖提取率的影響

超聲波時間對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖5。

圖5 超聲時間對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.5 The ultrasonic time influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

由圖5 可得，初期超聲波時間的加長，會使提取率升高，在30 min 時提取率最高，隨后卻出現(xiàn)了負(fù)相關(guān)趨勢，這可能是由于隨著超聲波輻射時間的加長，蛹蟲草菌體細(xì)胞壁充分破裂，致使越來越多的蟲草多糖流出，所以多糖的提取率也隨之升高，但時間逐漸加長也會導(dǎo)致部分蟲草多糖的糖苷鍵損壞，會有更多的蟲草多糖被降解，因此提取率又會降低。多糖提取的最佳超聲波時間為30 min，蛹蟲草多糖提取率為5.41%。所以后續(xù)單因素試驗(yàn)采用超聲波時間為30 min。

2.1.5 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響

提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響見圖6。

圖6 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.6 The extraction temperature influencing forextraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

溫度的高低設(shè)定是多糖提取過程中不可以忽略的一個因素，由圖6 可知，溫度與多糖提取率成正比，到60 ℃是最高，然后隨著溫度的升高，多糖提取率雖然同樣呈現(xiàn)出增高的趨勢，但增長極其緩慢，再考慮到能源消耗問題，采用60 ℃即可。故多糖提取的最佳溫度為60 ℃，蛹蟲草多糖提取率為5.53%。所以后續(xù)單因素試驗(yàn)采用提取溫度60 ℃。

2.1.6 超聲波提取次數(shù)對蛹蟲草多糖提取率的影響

提取次數(shù)對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖7。

圖7 超聲波提取次數(shù)對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.7 The extraction times influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

在多糖提取過程中，提取次數(shù)對得率大小存在一定的影響，提取次數(shù)越少，溶出的多糖就會更不完全，提取率越低，由圖7 可知，提取次數(shù)從2 次開始，提取率增長極其緩慢，故綜合操作的簡易性和經(jīng)濟(jì)因素，選擇提取2 次最佳，蛹蟲草多糖提取率為5.79%。所以后續(xù)單因素試驗(yàn)采用提取次數(shù)2 次。

2.1.7 乙醇和濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響

乙醇和濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖8。

圖8 乙醇和濃縮液之比對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.8 The ratio of ethanol to concentrate influencing for extraction rate of polysaccharide from Cordyceps militaris

分析圖8，得知當(dāng)乙醇與濃縮液之比逐漸增大時，多糖提取率增大，到達(dá)最大值以后，又隨著乙醇與濃縮液之比的增大反而開始出現(xiàn)降低的趨勢。由圖8 可知，多糖提取率最大值出現(xiàn)在乙醇與濃縮液之比為4 ∶1（體積比）時，蛹蟲草多糖提取率為6.11%。所以多糖提取過程中乙醇與濃縮液之比最佳應(yīng)控制在4 ∶1（體積比）。

2.2 L1（837）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取蛹蟲草多糖工藝的研究

正交試驗(yàn)優(yōu)化數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)對蛹蟲草多糖提取率影響分析Table 2 Orthogonal test analysis of the impact of extraction rate of Cordyceps militaris polysaccharides

續(xù)表2 正交試驗(yàn)對蛹蟲草多糖提取率影響分析Continue table 2 Orthogonal test analysis of the impact of extraction rate of Cordyceps militaris polysaccharides

表3 正交試驗(yàn)對蛹蟲草多糖提取率影響的顯著性分析Table 3 Orthogonal test of the impact of significant extraction rate of Cordyceps militaris polysaccharide analysis

由表2 可知，按照各個因素影響多糖最終得率的重要性可得：C＞A＞F＞G＞D＞E＞B，即超聲波功率＞物料粒度＞料液比＞乙醇與濃縮液體積比＞超聲波時間＞提取溫度＞提取次數(shù)，確定出了蛹蟲草多糖提取工藝的最佳試驗(yàn)組合為：A2B3C2D2E3F2G2。由表3 可知，物料粒度和超聲波功率對蛹蟲草多糖提取的得率都表現(xiàn)出顯著影響。采用得出的最佳提取工藝組合進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)，做3 個平行樣，通過計算平均數(shù)后得出蛹蟲草多糖得率為6.28%，高于熱水浸提法提取蛹蟲草菌絲體多糖的提取率（1.84%）[5]，也高于單獨(dú)采用超聲法提取蛹蟲草菌絲體多糖的提取率（5.57%）[10]或微波法提取蛹蟲草菌絲體多糖的提取率（5.78%）[17]，表明微波法和超聲波法協(xié)同提取蛹蟲草多糖具有意義。

2.3 蛹蟲草多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響

提取的蛹蟲草多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響見表4。

表4 蛹蟲草多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響Table 4 Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on proliferation of mouse spleen cells

如表4 所示，蛹蟲草多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組與對照組相比，SI 差異顯著（P＜0.05）；中劑量組和高劑量組與低劑量組相比，SI 差異顯著（P＜0.05）；中劑量組和高劑量組相比，SI 差異不顯著（P＞0.05）。低劑量組的SI 顯著低于中劑量組和高劑量組的SI，中劑量組對應(yīng)的SI 最大，表明此劑量時蛹蟲草多糖對小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最大，具有最強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，但隨著劑量的提高，高劑量組的免疫調(diào)節(jié)活性與中劑量組相比卻呈現(xiàn)出下降的趨勢。該結(jié)果與朱軼鋒等的報道類似：朱軼鋒等研究了不同濃度的黃芪多糖對ConA 誘導(dǎo)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對免疫調(diào)節(jié)活性有重要影響，在一定劑量范圍內(nèi)，隨著黃芪多糖劑量的提高，免疫調(diào)節(jié)活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[18]。

3 結(jié)論

從正交試驗(yàn)結(jié)果得出蛹蟲草多糖的最佳提取工藝條件是：物料粒度為0.150 mm，提取次數(shù)為3 次，微波功率400 W，超聲波功率為300 W，超聲波時間為30 min，提取溫度為 70 ℃，料液比為 1 ∶40（g/mL），乙醇與濃縮液體積比為4 ∶1。此條件下可得到多糖提取率為6.28%。超聲波功率、物料粒度對蛹蟲草多糖的得率均呈現(xiàn)出顯著的影響，其中，對蛹蟲草多糖得率影響最大的因素是超聲波功率。

蛹蟲草多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組的SI均大于1，表明不同劑量的蛹蟲草多糖對小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖活性均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，蛹蟲草多糖能明顯提高小鼠的免疫調(diào)節(jié)活性。在一定劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的提高，免疫調(diào)節(jié)活性也相應(yīng)的提高，但隨著劑量的進(jìn)一步提高，免疫調(diào)節(jié)活性并沒有相應(yīng)的提高，而是達(dá)到峰值后出現(xiàn)下降的趨勢，表明蛹蟲草多糖的免疫調(diào)節(jié)作用具有劑量效應(yīng)，只有在適宜的劑量時才具有較高的免疫調(diào)節(jié)活性，其機(jī)理還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。本試驗(yàn)僅檢測蛹蟲草多糖的免疫調(diào)節(jié)活性（細(xì)胞免疫試驗(yàn)），接下來將做非特異性免疫試驗(yàn)和體液免疫試驗(yàn)[16]，進(jìn)一步研究蛹蟲草多糖的免疫活性。