響應面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同輔助提取金柚幼果總黃酮工藝

王琴，羅潔瑩，柳建良，劉袆帆，*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東廣州510000；2.梅州市金柚研究院，廣東梅州514021）

金柚產(chǎn)于廣東省梅州市，是中國國家地理標志產(chǎn)品。金柚幼果指未成熟的金柚，為蕓香科、柑橘屬植物。柑橘屬座果率低，幼果由于生理原因凋落為生理落果，生理落果及疏果依然占很大比重[1]。金柚是產(chǎn)于梅州的沙田柚，其中含有多種生物活性物質(zhì)，張昭研究發(fā)現(xiàn)在10 個品種的柚果中黃烷酮含量最高的為沙田柚[2]，柑橘果實類黃酮的含量受成熟度影響，通常情況下，柑橘果實中的類黃酮含量在未成熟期累積，在成熟期下降，但在幼果中卻極為豐富[3]。此外相關研究表明柚子幼果的黃酮類物質(zhì)含量多于成熟果實[4]，黃酮類物質(zhì)目前在醫(yī)藥學上應用較為廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗癌、預防心血管疾病、糖尿病等功效。充分利用金柚幼果資源，將對環(huán)境的保護和提高金柚綜合利用價值有重大意義，而且對相關的產(chǎn)業(yè)，例如制藥行業(yè)、功能食品行業(yè)的發(fā)展等都有重要促進作用。

目前黃酮的提取方法主要有有機溶劑提取法、堿提酸沉法、酶解提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法。溶劑浸提法最為常見，但提取率較低，鄭培君等[5]采用響應面法優(yōu)化乙醇浸提柚皮總黃酮，提取率為0.864%；項飛[6]以堿提酸沉法將提取液中的黃酮類物質(zhì)的純度提高到34.23%；酶法提取條件溫和、能耗低、無污染，余先純等[7]采用微波聯(lián)合酶法提取柚皮黃酮，提取率為5.93%；超臨界流體萃取法作為一種通用高效的分離技術而應用，利用超臨界CO2萃取胡柚皮中總黃酮的研究中，夏其樂等[8]優(yōu)化此工藝并將得率提高至1.01 mg/g；超聲波輔助提取有助于植物細胞的破裂，姚翔等[9]使超聲波輔助法提取湖南香柚皮中黃酮類物質(zhì)得到優(yōu)化，提取率為2.42%；微波法具有高效性和強選擇性，戴玉錦等[10]利用微波輔助法提取蜜柚皮中黃酮類物質(zhì)，并將得率提高至0.884 mg/g。麻明友等[11]通過試驗發(fā)現(xiàn)，超聲微波雙輔助提取柑橘皮黃酮比單獨采用超聲或微波輔助提取得到的柑橘皮總黃酮提取率高10.9%和9.7%，所以本文采用超聲-微波協(xié)同輔助技術提取金柚幼果黃酮，對總黃酮的提取工藝優(yōu)化作重點研究，以黃酮得率為指標，通過單因素和響應面試驗，確定最優(yōu)的提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金柚：廣東省梅州市；金柚凍干粉：仲愷農(nóng)業(yè)工程學院落葉果樹實驗室自制；超純水：仲愷農(nóng)業(yè)工程學院自制。

1.2 主要試劑

橙皮苷標準品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；一縮二乙二醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器

SL-SM 型超聲波-微波協(xié)同反應系統(tǒng)：南京西安歐儀器制造有限公司；TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；FD-1C-50 冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；PHS-25 數(shù)顯pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；FA1204B 分析天平：上海精科天美科學儀器有限公司；SC-3610 低速離心機：安徽中佳科學儀器有限公司；HH-2 恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；BO-250S1 高速多功能粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.4 方法

1.4.1 提取工藝

金柚幼果→切碎→凍干→制粉→過60 目篩→稱取原料→加入60%乙醇→微波-超聲協(xié)同輔助提取→4 000 r/min 離心10 min→得上清液→測定總黃酮

1.4.2 橙皮苷標準曲線的制作

參考NY/T2010-2011《柑橘類水果及制品中總黃酮含量的測定》的方法[12]，稱取20.0 mg 橙皮苷，在氫氧化鈉溶液中溶解，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.0，并用水定容至100 mL，得標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。準確吸取 0、0.5、1.00、1.5、2.00、2.5、3.00、3.5、4.00、4.5、5.00 mL橙皮苷標準溶液，在堿性條件下與一縮二乙二醇溶液在40 ℃水浴中10 min，冷水浴中5 min。在波長420 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，為y=0.006 3x+0.014 1，R2=0.999。

1.4.3 樣品的測定

吸取2.5 mL 試液于10 mL 具塞試管中，用試劑空白溶液定容至4.90 mL，準確加入5 mL90%一縮二乙二醇溶液，搖勻后加0.1 mL 160.0 g/L 氫氧化鈉溶液，搖勻。將各試管置于40 ℃水浴中保溫10 min；取出，在冷水浴中冷卻5 min。同時吸取一份等量的試液，不加氫氧化鈉溶液，作為本底空白，以本底空白溶液調(diào)零，測定試液吸光度，根據(jù)標準曲線求出試樣溶液的總黃酮質(zhì)量濃度。

1.4.4 單因素試驗

以總黃酮得率為評價指標，分別考察以60%乙醇溶液為提取劑時不同微波功率（0、100、200、300、400、500、600 W）、不同超聲波功率（0、100、200、300、400、500、600 W）、不同液料比（5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g））、不同提取時間（10、20、30、40、50、60 min）下對金柚幼果黃酮提取得率的影響，每組試驗進行3 次平行，為避免高溫引起黃酮類化合物的分解，提取溫度控制在（60±2）℃。

1.4.5 響應面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以黃酮的提取率為考察指標，以微波功率、超聲波功率、液料比、提取時間為考察因素，各取3 個水平，進行響應面試驗設計并確定金柚幼果黃酮的最優(yōu)提取工藝條件。

1.4.6 總黃酮得率的計算

黃酮與堿作用，開環(huán)生成2，6-二羥基-4-環(huán)氧基苯丙酮和對甲氧基苯甲醛；在一縮二乙醇環(huán)境中遇堿縮合生成黃色橙皮素査耳酮，其生成量相當于橙皮苷的量；在波長420 nm 處比色測定吸光度，扣除本底后，與標準曲線比較定量。

總黃酮的得率按照提取目標物的質(zhì)量占原料質(zhì)量的百分比計算。為了將吸光度控制在0.3～0.8 之間，得出總黃酮得率R 的計算如下：

式中：N 為稀釋倍數(shù)；c 為金柚幼果總黃酮提取物的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為根據(jù)不同料液比加入的提取劑的體積，mL；V3為測定時從提取液中吸取體積后定容的體積，mL；m 為提取原料的質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均做3 次平行，結(jié)果以平均值±標準方差表示。采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件單因素方差分析和Tukey’s multiple range test 進行顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對金柚幼果總黃酮得率的影響

微波的高能作用能使細胞膜破裂，加快細胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，加劇分子運動，所以微波功率是影響總黃酮得率的重要因素[13]。以總黃酮的提取率為考察指標，固定以60%乙醇為提取劑，超聲波功率為100 W，液料比為 20 ∶1（mL/g），提取時間為 30 min。微波功率對總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 微波功率對總黃酮得率的影響Fig.1 Influence of microwave power on total flavonoids yield

由圖1 可知，在0～400 W 的微波功率范圍內(nèi)，總黃酮得率隨微波功率的增大而提高，功率為400 W 時提取率大幅度增加，達到67.22%，500 W 時提取率增加不明顯，微波功率超過500 W 后，微波功率增大引起提取率下降。在一定的提取時間內(nèi)，微波功率的上升使反應體系的溫度升高，促進目標成分在固液兩相的移動，同時促進細胞破裂、釋放胞內(nèi)成分，使原料的內(nèi)容物充分溶出，從而提高總黃酮的提取量[14]。當微波功率達到一定水平時，瞬時的加熱導致體系局部受熱嚴重，黃酮類物質(zhì)因過熱而被分解，提取率降低。且通過顯著性分析，微波功率在400 W 與0～300 W 條件下的提取率有顯著差異，與500 W～600 W 條件下的提取率無明顯差異（p＜0.05），從節(jié)約成本角度考慮，微波功率選擇400 W 為最佳提取條件。

2.1.2 超聲波功率對金柚幼果總黃酮得率的影響

超聲的空化作用同樣能使細胞破裂，而且超聲產(chǎn)生的攪拌及振蕩充分彌補了微波得缺點，如傳質(zhì)、傳熱不均勻等[15-19]。試驗考察不同超聲波功率（0、100、200、300、400、500、600 W）對總黃酮得率的影響，以總黃酮的提取率為考察指標，固定以60%乙醇為提取劑，微波功率為 100 W，液料比為 20 ∶1（mL/g），提取時間為30 min。超聲波功率對總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 超聲波功率對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield

由圖2 可知，超聲波功率在0～400 W 范圍內(nèi)，總黃酮的提取率隨超聲波功率的增大整體呈上升趨勢，在400 W 處達到最大值，提取率為42.52%，在超聲波功率達到400 W 后，提取率呈下降趨勢。超聲波作用于提取體系，使細胞壁因空化作用以及強烈的振動效應下被擊破，促進胞內(nèi)的有效成分溶出，且功率越大作用效果越強，但對于一定頻率和一定發(fā)射面的超聲來說，聲強隨著功率的增大而增大，聲壓幅值以及液體中的壓力也隨之增大，過高的聲強產(chǎn)生大量空化泡通過反射而減少了能量的傳遞，不利于提取的進行[20]。且通過顯著性分析，超聲波功率在400 W 與0～300 W條件下的提取率有顯著差異，與500 W～600 W 條件下的提取率無明顯差異（p＜0.05），所以超聲波功率選擇400 W 為最佳提取條件。

2.1.3 液料比對金柚幼果總黃酮得率的影響

液料比是影響總黃酮得率的重要因素之一，溶劑和原料在形成合適的濃度梯度時，將促進目標產(chǎn)物的溶出，提高浸提效率。試驗考察不同液料比[5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）]對總黃酮得率的影響，以總黃酮的提取率為考察指標，固定以60 %乙醇為提取劑，微波功率為100 W，超聲波功率為100 W，提取時間為30 min。料液比對總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 液料比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on total flavonoids yield

如圖3 所示，當液料比為 10 ∶1（mL/g）時，金柚幼果總黃酮得率達最大值，為55.65%。原料與溶劑的比值增大，使提取過程中的目標成分之間形成的濃度梯度擴大，進而促進目標成分的溶出，當提取量到達一定值后，再繼續(xù)增大溶劑的用量，反而會促使細胞內(nèi)其他物質(zhì)的溶出，與目標成分相競爭，抑制目標成分的溶出，并且溶劑量過大會給超聲波微波作用在反應體系過程帶來更大的阻力，因而提取率有所下降[21]。通過顯著性分析，液料比在10 ∶1（mL/g）與其他比例條件下的提取率有顯著差異（p＜0.05），所以初步確定液料比為 10 ∶1（mL/g）為最佳提取條件。

2.1.4 提取時間對金柚幼果總黃酮得率的影響

提取時間的長短與總黃酮得率和能耗息息相關。提取時間不足則造成提取不充分，但提取時間過長，相當于微波超聲波的作用時間延長，黃酮類物質(zhì)有可能因此被分解，降低總黃酮的提取率。試驗考察不同提取時間（10、20、30、40、50、60 min）對總黃酮得率的影響，以總黃酮的提取率為考察指標，固定以60%乙醇為提取劑，微波功率為100 W，超聲波功率為100 W，液料比為20 ∶1（mL/g）。時間對總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Influence of extraction time on total flavonoids yield

如圖4 所示，提取時間在40 min 時，總黃酮的提取率達到最大值，為48.99%。在提取時間在10 min～30 min 之間，提取率不高，原因是提取時間不足，提取不充分，超聲-微波聯(lián)合作用沒能發(fā)揮到最大的作用，提取時間超過40 min 后，總黃酮的提取率略有下降，可能是時間的延長，體系內(nèi)其他雜質(zhì)陸續(xù)溶出，抑制黃酮類物質(zhì)的提取效率，另外，黃酮類物質(zhì)長時間處于超聲波和微波的作用下會使其被分解破壞。通過顯著性分析，提取時間在40 min 與10 min～30 min 條件下的提取率有顯著差異，與50 min 條件下的提取率無明顯差異（p＜0.05），所以提取時間暫定為40 min 最適宜。

2.2 響應面試驗優(yōu)化提取工藝

2.2.1 因素的選取及方案

綜合上述單因素的試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，試驗固定以60%乙醇溶液為提取劑，選定微波功率、超聲波功率、液料比和提取時間這4 個因素作為響應面分析試驗的因素，采用四因素三水平響應面分析法，利用Design-Expert 11 軟件對數(shù)據(jù)進行擬合優(yōu)化金柚幼果總黃酮的提取工藝。設計的分析試驗的因素與水平見表1。

表1 響應面分析試驗因素與水平表Table 1 Response surface analysis of test factors and levels

以A、B、C、D 為自變量，以金柚幼果總黃酮得率為響應值（Y），試驗方案與試驗結(jié)果見表2。其中1 號～23 號為析因試驗，24 號～27 號為中心試驗。

2.2.2 二次方程數(shù)學模型的建立

針對響應面分析試驗結(jié)果，應用Design Expert 進行回歸擬合分析，得到各提取條件和總黃酮得率之間的二次多項式方程模型為：

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

由方程中一次項系數(shù)可得出影響金柚幼果總黃酮得率的因素由強到弱依次為B＞A＞D＞C，即超聲波功率＞微波功率＞提取時間＞液料比。

2.2.3 方差分析結(jié)果

對模型的回歸方程進行方差分析，以檢驗二次回歸模型的顯著性，分析結(jié)果見表3。

根據(jù)表3 的分析結(jié)果可知，整體模型P 值＜0.01，說明該模型極為顯著，一次項A、B、C 和D 均為極顯著（p＜0.01），AB、AD 交互作用顯著（p＜0.05），AC、BC、BD、CD 交互作用不明顯（p＞0.05），二次項 A2、B2、C2和D2均極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p 值＞0.05），表明該數(shù)學模型與實際提取情況擬合很好，另外預測的R2=0.982 1 與調(diào)整后的Radj2=0.961 2 兩者差值小于0.2，說明理論預測值和試驗測定值之間具有良好的相關性，精密度指測量信號與噪聲的比值，精密度大于4代表該模型可用于進行預測，以上數(shù)據(jù)表明試驗所得模型適合用于金柚幼果總黃酮得率響應值的預測。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.4 響應曲面分析

通過上述方差分析可知，微波功率和超聲波功率以及微波功率和提取時間對總黃酮得率存在顯著交互作用，為了更直觀地描述各因素之間的交互作用，進一步優(yōu)化金柚幼果的超聲-微波協(xié)同輔助提取工藝條件，結(jié)合Deign Expert 軟件擬合出該模型的響應面立體圖，如圖6～圖11 所示。

微波功率和超聲波功率的交互作用對總黃酮的提取率有非常顯著的影響，響應曲面陡峭，等高線呈橢圓形，在圖形的中心區(qū)域能得到一個理論最大值。

微波功率和液料比對總黃酮的提取率的交互作用影響不顯著，響應曲面陡峭，但等高線呈圓形，在圖形的中心區(qū)域能得到一個理論最大值。

圖5 微波功率和超聲波功率對總黃酮得率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.5 Response surface stereogram and contour map of the interaction between microwave power and ultrasonic power on total flavonoids yield

圖6 微波功率和液料比對總黃酮得率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.6 Response surface stereogram and contour map of the interaction of microwave power and liquid-solid ratio of total flavonoids yield

圖7 微波功率和提取時間對總黃酮得率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.7 Response surface stereogram and sontour map of the interaction between microwave power and extraction time on total flavonoids yield

微波功率和提取時間的交互作用對總黃酮的提取率有非常顯著的影響，響應曲面陡峭，等高線呈橢圓形，在圖形的中心區(qū)域能得到一個理論最大值。

超聲波和液料比對總黃酮的提取率的交互作用影響不顯著，響應曲面較陡峭，但等高線趨近圓形，在圖形的中心區(qū)域能得到一個理論最大值。

超聲波和提取時間對總黃酮的提取率的交互作用影響不顯著，響應曲面較陡峭，但等高線趨近圓形，在圖形的中心區(qū)域能得到一個理論最大值。

液料比和提取時間對總黃酮的提取率的交互作用影響不顯著，響應曲面較陡峭，但等高線趨近圓形，在圖形的中心區(qū)域能得到一個理論最大值。

圖8 超聲波功率和液料比對總黃酮得率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.8 Response surface stereogram and contour map of the interaction between ultrasonic power and liquid-solid ratio of total flavonoids yield

圖9 超聲波功率和提取時間對總黃酮得率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.9 Response surface stereogram and contour map of the interaction of ultrasonic power and extraction time of total flavonoids yield

圖10 液料比和提取時間對總黃酮得率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.10 Response surface stereogram and contour map of the interaction of total flavonoids yield with liquid-solid ratio and extraction time

立體圖的頂端和等高線圖中所標出的點為最大值，說明在分析的因素水平范圍中存在極值。預測在微波功率為410.537 W，超聲波功率為419.448 W，液料比為10.576，提取時間為41.715 min 時，金柚幼果總黃酮的提取率將達最大值，為70.03%?？紤]到實際情況，最優(yōu)提取工藝條件設定為微波功率為410 W，超聲波功率為 420 W，液料比為 11 ∶1（mL/g），提取時間為 42 min。

2.2.5 響應面因素交互作用分析

根據(jù)響應面模型方差分析表，微波功率、超聲波功率、液料比、提取時間之間的交互作用響應面立體圖和等高線圖，利用JMP 14 分析得出微波功率、超聲波功率、液料比、提取時間之間的交互作用關系圖，作進一步分析。

圖11 微波功率、超聲波功率、液料比和提取時間間的交互作用圖Fig.11 Interaction between microwave power，ultrasonic power，liquid-solid ratio and extraction time

交互作用關系圖中，曲線的彎曲程度越大，表明這種因素隨著相應的變量因素的變化而明顯變化。從圖12 中可以看出，隨微波功率的變化，不同超聲波功率、不同液料比和不同提取時間之間提取率變化較大，每條曲線的斜率變化很大，因此微波功率與超聲波功率、液料比和提取時間之間交互作用均明顯。隨超聲波功率的變化，不同液料比和不同提取時間之間的提取率變化較小，每條曲線的斜率變化很小，因此超聲波功率與液料比和提取時間之間的交互作用均不明顯。隨液料比的變化，不同提取時間之間的提取率變化較小，每條曲線的斜率變化很小，因此液料比和提取時間之間的交互作用不明顯。

2.2.6 響應面優(yōu)化結(jié)果及模型驗證試驗

根據(jù)響應面設計試驗，應用JMP 14 進行擬合模型最小二乘法分析，得到金柚幼果總黃酮得率的分子刻畫器和預測刻畫值如圖13～圖14 所示，金柚幼果總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件為：微波功率411W，超聲波功率 420 W、液料比 11 ∶1（mL/g），提取時間 42 min，總黃酮最大得率為68.57%。與2.1.1 結(jié)果相比，兩者提取率相當，但優(yōu)化后實際結(jié)果能節(jié)約提取溶劑消耗量，減少廢液處理成本。優(yōu)化后實際結(jié)果與Design Expert預測的最優(yōu)提取工藝條件相近。金柚幼果總黃酮得率實際值與預測值的關系圖如圖13 所示，說明該模型能指導金柚幼果總黃酮提取工藝條件的優(yōu)化。

圖12 金柚幼果總黃酮得率預測值-實際值圖Fig.12 Predicted value-actual value of total flavonoid extraction rate of pomelo young fruit

為了驗證模型的可靠性，按照優(yōu)化得到的最佳工藝條件進行3 次平行試驗，金柚幼果總黃酮的提取率為（68.57±2.43）%，與預測值接近，因此模型能有效指導金柚幼果總黃酮提取的條件優(yōu)化。同時，與金柚成熟果實中黃酮提取率相比，利用閃式提取法提取胡柚皮中黃酮類化合物，得到的柚皮黃酮提取率為4.37%[22]。利用超聲波法提取蜜柚果皮中的總黃酮，蜜柚果皮黃酮得率為6.667 mg/g[23]。金柚幼果黃酮含量高于成熟果黃酮含量，有利于金柚幼果資源利用率提高。

圖13 預測刻畫器Fig.13 Prediction descriptor

3 結(jié)論

本試驗利用響應面分析法對金柚幼果黃酮的超聲-微波協(xié)同輔助提取工藝進行優(yōu)化。首先通過單因素試驗，分別研究提取過程中微波功率、超聲波功率、液料比和提取時間4 個因素對金柚幼果總黃酮得率的影響。在此基礎上，以微波功率、超聲波功率、液料比和提取時間作為試驗因子，采用四因素三水平的響應面分析法進行試驗，分析數(shù)據(jù)后得出金柚幼果最優(yōu)提取工藝參數(shù)是微波功率為410 W，超聲波功率為420 W，液料比為 11 ∶1（mL/g），提取時間為 42 min，經(jīng)過方差分析、分子刻畫器和預測刻畫器均顯示模型擬合度較高。通過驗證性試驗證實此工藝條件下總黃酮的提取率達68.57%，與模型的預測值70.03%十分接近。由此可見，該模型能有效指導金柚幼果總黃酮得率工藝條件的優(yōu)化，通過響應面分析法優(yōu)化金柚幼果總黃酮提取工藝在實踐上是可行的。