響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方北冬蟲夏草顆粒多糖提取工藝的研究

李英娜，潘美彤，苑廣信，安麗萍，徐廣宇

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

失眠可引起患者焦慮、抑郁或恐懼心理，并導(dǎo)致精神活動效率下降，日益成為威脅人類健康的殺手[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，我國失眠人群大約占55%。流行病學(xué)調(diào)查顯示，失眠的患病率為40%左右[2]。失眠會帶來一系列的危害，降低生活質(zhì)量、加快衰老，嚴重影響人們的正常生活和身體健康[3]。

中藥在我國有著悠久的歷史，其來源于天然產(chǎn)物，毒副作用較小，可以長期服用，因此特別適合于睡眠障礙等亞健康狀態(tài)的調(diào)理和治療[4]。復(fù)方北冬蟲夏草顆粒是本團隊根據(jù)中醫(yī)理論將北冬蟲夏草、靈芝、甘草、大棗、小麥、桔梗進行科學(xué)配伍，開發(fā)的一種有助于改善睡眠的復(fù)方保健食品，其主要功效成分為多糖。多糖具有多種生物活性功能，被廣泛應(yīng)用到功能食品和臨床上[5]。為了更有效地提取多糖，充分利用資源，提高復(fù)方北冬蟲夏草顆粒質(zhì)量，本研究通過設(shè)計星點Box-Behnken 響應(yīng)面試驗，對多糖提取工藝進行優(yōu)化，以期為復(fù)方北冬蟲夏草顆粒的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 材料和試劑

甘草、桔梗、小麥：安國市深豪藥業(yè)有限公司；北冬蟲夏草：沈陽聚鑫北蟲草菌業(yè)有限公司；靈芝：河北百合中藥飲片有限公司；大棗：樟樹市慶仁中藥飲片有限公司；無水乙醇：遼寧泉瑞試劑有限公司；重蒸酚：沈陽鼎國有限公司；濃硫酸：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；葡萄糖標準品：上海宏瑞化工有限公司；試驗所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

AL204 電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH S1-Ni 電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠；GZX-9140ME 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司；4 ℃冷藏冰箱：青島海爾集團公司；LC-4012 臺式離心機：美國eppeendorf 公司；XW-80A 旋渦混合器：上海青浦滬西儀器廠；UV-2550 紫外可見分光光度計：島津國際貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 物料的前處理

北冬蟲夏草、甘草、桔梗、小麥：使用前過20 目篩，除去雜質(zhì)、異物，備用；大棗，靈芝：使用前過20 目篩，除去雜質(zhì)、異物，破碎成小塊，備用[6]。

2.2 多糖的提取方法

取配方比例的北冬蟲夏草2 g、甘草6 g、桔梗6 g、靈芝 6 g、小麥 18 g、大棗 12 g，共 50 g，準備 17 份，按照響應(yīng)面法設(shè)計方案進行提取、過濾，合并每次濾液、濃縮、干燥、粉碎得干膏粉，測定出膏率及干膏粉中粗多糖含量。以100 g 藥材中粗多糖的提取得量為指標，進行數(shù)據(jù)分析。

1）出膏率的計算：出膏率/%=干膏粉得量/投藥材總量×100

2）粗多糖的測定：參考《保健食品功效成分檢測方法》（2011 年版）中“粗多糖的苯酚-硫酸分光光度測定法”測定[7]。

葡萄糖標準曲線的繪制，取干燥后的無水葡萄糖對照品20.00 mg，置于200 mL 容量瓶中，加適量去離子水溶解，稀釋至刻線，振蕩搖勻，該液體即為葡萄糖標準溶液0.1 mg/mL。在25.0 mL 比色管中，分別量取葡萄糖標準品溶液 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，添加去離子水至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，渦旋混合器混勻10 s，加入濃硫酸10.0 mL，渦旋混合器混勻35 s，置于沸水浴2 min，自然冷卻至21 ℃，用紫外-可見分光光度儀檢測樣品在485 nm 處的吸光度，每個樣品平行測定3 次[6]。以葡萄糖濃度作橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出葡萄糖標準曲線。曲線方程為：y=0.013 7x+0.009 5，R2=0.999 6。

具體樣品處理過程：取干浸膏50 mg，加適量水，振搖使溶解，定容至100 mL，取2.0 mL 于15 mL 離心管中，加8.0 mL 無水乙醇，混勻，4 ℃冰箱靜置過夜。4 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，反復(fù)4 次。洗滌后的殘渣用水溶解并定容于10 mL 容量瓶中，待備用。取適量樣品溶液，補加蒸餾水至2.0 mL，混勻后加入1.0 mL 5%苯酚溶液，渦旋混合器混勻10 s，加入濃硫酸10.0 mL[8]，渦旋混合器混勻35 s。置于沸水浴2 min，自然冷卻至21 ℃，紫外分光光度計在485 nm 波長處檢測吸光度，計算樣品的粗多糖含量[9]。

3）100 g 藥材中粗多糖得率/%=多糖含量/樣品質(zhì)量×100

2.3 單因素試驗設(shè)計

在料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），提取時間分別為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，浸泡時間分別為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次數(shù) 1、2、3、4 次的條件下，按照2.2 的得率計算方法，進行料液比、提取時間、浸泡時間、提取次數(shù)4 個因素對復(fù)方北冬蟲夏草顆粒多糖得率的影響試驗。

2.4 Box-Behnken 設(shè)計星點響應(yīng)面法試驗設(shè)計

本研究根據(jù)星點設(shè)計原理，通過對保健品多糖提取率的主要影響因素：料液比（A）、提取時間（B）、浸泡時間（C）進行了優(yōu)化試驗。綜合多因素考慮，試驗采用三因素三水平對提取工藝進行優(yōu)化，因素水平見表1，并對所得數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，求得回歸方程。

表1 試驗因素水平編碼Table 1 The level coding of experimental factors

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比對多糖得率的影響

在提取時間為2 h、浸泡時間為2 h、提取次數(shù)為3 次的條件下，料液比分別為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）下進行料液比對多糖得率的影響試驗，見圖1。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratio of solid to liquid on yield of polysaccharide

由圖1 可知，多糖得率在料液比從 1 ∶5（g/mL）至1 ∶15（g/mL）之間呈依次遞增的趨勢，并且料液比在1 ∶15（g/mL）時達到最大值，再增加溶液體積，提取率反而緩慢降低，同時增加液體體積還增加濃縮的工作量，從而增加了成本，因此，選擇適宜的料液比為1 ∶15（g/mL）。

3.1.2 提取時間對多糖得率的影響

在料液比為 1 ∶15（g/mL）、浸泡時間為 2 h、提取次數(shù)為3 次的條件下，選取提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，進行提取時間對多糖得率的影響試驗，見圖2。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide yield

由圖2 可知，多糖得率在提取時間從0.5 h 至2 h之間呈遞增的趨勢，并且提取時間在2 h 時達到較大值，往后趨于平緩。表明提取時間在一定范圍內(nèi)可以增加多糖得率，但時間過長會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞。因此，結(jié)合多糖得率以及在節(jié)省時間的考慮下，選擇較優(yōu)的提取時間為2 h。

3.1.3 浸泡時間對多糖得率的影響

在料液比為 1 ∶15（g/mL）、提取時間為 2 h、提取次數(shù)為3 次的條件下，選取浸泡時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 進行浸泡時間對多糖得率的影響試驗，見圖3。

圖3 浸泡時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of soaking time on polysaccharide yield

由圖3 可知，多糖得率在浸泡時間從0.5 h 至2 h之間呈依次遞增的趨勢，并且浸泡時間為2 h 時達較大值。多糖得率從2 h 至3 h 放緩，可能是由于2 h 時復(fù)方北冬蟲夏草多糖已經(jīng)大部分浸泡出來。因此，結(jié)合多糖得率和實際操作選擇較優(yōu)的浸泡時間為2 h。

3.1.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響

在料液比為 1 ∶15（g/mL）、提取時間為 2 h、浸泡時間為2 h 的條件下，選取提取次數(shù)分別為1、2、3、4 次下進行提取次數(shù)對多糖得率的影響試驗，見圖4。

圖4 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the yield of polysaccharide

由圖4 可知，多糖得率隨提取次數(shù)的增加而上升，提取3 次時多糖基本已被提取出來，此后繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖得率呈緩慢上升趨勢。因此，從工作量和成本考慮，選取3 次為單因素試驗最佳提取次數(shù)。

3.2 Box-Behnken設(shè)計星點響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗結(jié)果

本研究根據(jù)星點試驗設(shè)計，保健品多糖的提取工藝進行優(yōu)化。試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Design and test results of response surface methodology

通過對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic regression

由表3 可以看出，模型的P＜0.01，表明模型高度顯著，調(diào)整確定系數(shù)R2=90.18，說明試驗數(shù)據(jù)真實可靠。在方差分析中，該模型的F 值為7.14，P＜0.01，表明回歸方程擬合度好且具有統(tǒng)計學(xué)意義。模型失擬項的P＞0.05，說明未知因素對試驗結(jié)果的干擾很小，失擬項差異不顯著，試驗無失擬因素存在，能充分反映實際情況，回歸模型是適合的[10]；試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.901 8，說明多糖得率的結(jié)果與模型預(yù)測結(jié)果有著良好的一致性，試驗?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)R2Adj=0.775 6，試驗結(jié)果有77.56%受試驗因素的影響。因此，結(jié)果可靠，此模型可以對多糖得率結(jié)果進行分析和預(yù)測。

響應(yīng)面分析法是一種用于在多因素系統(tǒng)中尋找最佳測試條件的統(tǒng)計方法[11]。利用Design-Expert 8.0軟件[12]對表3 試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到多糖含量對料液比（A）、提取時間（B）、浸泡時間（C）的回歸模型方程為：R1=31.07+1.73×A-0.14×B+1.32×C+0.35×AB-0.45×AC-0.58×BC-2.21×A2-1.62×B2-1.64×C2（R2=0.901 8）。

回歸方程各項方差分析中F 檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對多糖得率影響的主次順序為料液比＞浸泡時間＞提取時間，即料液比對多糖得率的影響最大，其次是浸泡時間，最后是提取時間。由回歸方程和方差分析還可知[13]，模型中一次項料液比對多糖得率的影響達到極顯著水平（P＜0.01），因素C 對多糖具有顯著影響（P＜0.05），提取時間及其余各項的影響均不顯著（P＞0.05）；模型中二次項A2對多糖得率的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；且料液比、浸泡時間、提取時間對總黃酮保留率的影響均不具有顯著的交互性（P＞0.05）。

3.3 通過Box-Behnken試驗得到的多元二次回歸模型所作的響應(yīng)面圖

本研究又通過Box-Behnken 試驗得到的多元二次回歸模型所作的響應(yīng)面圖見圖5～圖7，響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗因素A、B、C 所構(gòu)成的三維空間的曲面圖。在其他試驗因素固定不變的情況下，考察交互項對得率的影響，響應(yīng)面分析圖可用于評價試驗因素對多糖得率影響的兩兩交互作用[14]。

響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，該因素對多糖得率的影響越大；反之則表明因素對多糖得率的影響越小[14]。通過觀察，響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映料液比（A）、提取時間（B）、浸泡時間（C）之間交互作用對多糖提取量的影響，當?shù)雀呔€呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著[15]。

圖5 料液比與提取時間的等高線與響應(yīng)面（C=0）Fig.5 Contour and response surface of liquid-to-liquid ratioand extraction time（C=0）

圖6 料液比與浸泡時間的等高線與響應(yīng)面（B=0）Fig.6 Contour and response surface of liquid-to-liquid ratioand soaking time（B=0）

圖7 提取時間與浸泡時間的等高線與響應(yīng)面（A=0）Fig.7 Contour and response planes for extraction time and soak time（A=0）

由圖5 可知，當A 料液比一定時，多糖提取率隨著提取時間的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；同樣，當B 提取時間一定時，多糖提取率隨著A 料液比的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。

由圖6 可知，當C 浸泡時間一定時，多糖提取率隨A 料液比的增加呈現(xiàn)出增大趨勢；當A 料液比一定時，多糖提取率隨著C 浸泡時間的增加呈現(xiàn)出減小趨勢。

由圖7 可知，當B 提取時間一定時，多糖提取率率隨C 浸泡時間的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢；當C浸泡時間一定時，多糖提取率隨B 提取時間的增加呈現(xiàn)出先增加后趨于減小的趨勢。通過分析三者的交互作用，發(fā)現(xiàn)因素B 與C 的相互作用對多糖提取率影響最大。

3.4 組合物最佳提取工藝驗證試驗

通過優(yōu)化后的提取條件（提取時間2 h、浸泡時間2.4 h、料液比 1 ∶16.75（g/mL）對保健品多糖提取進行驗證試驗，分別進行了5 次重復(fù)試驗，結(jié)果分別為32.17 %、32.15 %、32.16 %、32.17 %、32.18 %，平均32.17%，與理論值32.21%非常接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化保健品多糖提取工藝方法可行可靠。

4 結(jié)論

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[16-18]。與正交試驗設(shè)計法不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，可研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[19]。本研究以水提法提取保健品組合物中的多糖，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了工藝。最佳提取條件為料液比 1 ∶16.75（g/mL）、提取時間 1.93 h、浸泡時間 2.37 h、提取次數(shù)3 次。利用響應(yīng)面分析法所得結(jié)果表明料液比對中藥多糖得率影響最大，再者是浸泡時間和提取時間，通過對提取工藝的優(yōu)化，特別是對提取時間的調(diào)控，可以獲得較高的多糖得率[20-22]。保健品多糖提取工藝的優(yōu)化可以有效地提高多糖得率，提高保健品的綜合利用率，為保健品的進一步應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。