胃癌組織中miR-106b、BTG3的表達(dá)變化及意義

楊儉，薛輝，穆素恩，艾蓉，范紅偉

石家莊市第一醫(yī)院，石家莊050031

胃癌是起源于胃黏膜上皮的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有進(jìn)展快、惡性程度高及預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人們生命安全。據(jù)循證醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，每年新發(fā)和死亡的胃癌患者數(shù)量均占世界的40%[1]。由于胃癌早期診斷困難，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展到中晚期。盡管手術(shù)或放化療等治療方式可以適當(dāng)延長(zhǎng)胃癌患者生命，但其預(yù)后仍較差且5年存活率不足10%[2]。微小RNA(miRNA)是真核生物中普遍存在的小分子單鏈RNA，其長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，具有非編碼性和高度保守性，能夠調(diào)節(jié)mRNA的降解并抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯水平[3]。miR-106b位于染色體7q22.1，參與調(diào)控細(xì)胞周期、DNA復(fù)制以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程[4]。既往研究表明，miR-106b在胃癌組織中異常表達(dá)，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移，但其在胃癌組織中的具體作用機(jī)制少見(jiàn)報(bào)道[5]。B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因3(BTG3)是一種抑癌基因，屬于酪氨酸激酶受體2(ErbB2)基因傳導(dǎo)體家族，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及抑制癌細(xì)胞無(wú)限增殖等具有重要作用[6]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生損傷或受生長(zhǎng)因子刺激時(shí)BTG3表達(dá)明顯上調(diào)，且在G1/S過(guò)渡期達(dá)最高峰，從而抑制細(xì)胞不斷增殖[7]。本研究探討胃癌組織中miR-106b、BTG3的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2017年3月～2019年3月本院收治的103例胃癌患者臨床資料，男57例、女46例，年齡43～69(55.26±4.34)歲，腫瘤直徑≤5 cm 58例、>5 cm 45例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移82例，高分化52例、中分化39例、低分化12例、有脈管癌栓27例、無(wú)脈管癌栓76例，TNM分期Ⅰ期35例、Ⅱ期43例、Ⅲ期19例、Ⅳ期6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為胃癌；臨床病理資料完整，且愿意配合研究；均首次診斷為胃癌，且胃部無(wú)既往手術(shù)史或放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：直腸癌、肝癌及胰腺癌等惡性腫瘤；胃穿孔、胃間質(zhì)瘤及胃淋巴瘤等胃部疾病；先天免疫功能缺陷或其他遺傳性疾??；嚴(yán)重肝腎功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，且患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 胃癌組織及其癌旁正常組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 于術(shù)中采集胃癌組織及其癌旁(距腫瘤邊緣>5 cm)正常組織，均用液氮保存，術(shù)后統(tǒng)一放入-80 ℃冰箱中保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。各取組織60 mg，分別加入TRIzol試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)1 mL提取總RNA。應(yīng)用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒，將15 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件均為16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。選用TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Premix Ex Taq 試劑盒定量檢測(cè)miR-106b、BTG3的表達(dá)。miR-106b的上游引物序列為5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′、下游引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，內(nèi)參基因U6的上游引物序列為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′、下游引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；BTG3的上游引物序列為5′-TGTGCTGTCGGTATGGAGAG-3′、下游引物序列為5′-TCTGGTACACAGGACTTGCG-3′，內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火及延伸30 s共45個(gè)循環(huán)。以上引物均由上海生工公司合成生產(chǎn)，且每個(gè)樣本均檢測(cè)3次。使用U6和GAPDH作為內(nèi)參基因，應(yīng)用相對(duì)Ct值法評(píng)估不同樣品的 Ct值，miR-106b和BTG3的表達(dá)量相對(duì)于GAPDH和U6的比值為2-ΔΔCt，其中 Ct=C目的基因-Ct內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及其癌旁正常組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達(dá)比較 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-106b相對(duì)表達(dá)量分別為4.56±1.02、1.26±0.32，BTG3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.57±0.14、1.21±0.37。胃癌組織中miR-106b相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織高(t=31.329，P=0.000)，BTG3相對(duì)表達(dá)量較癌旁正常組織低(t=16.419，P=0.000)。

2.2 胃癌組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中miR-106b的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。胃癌組織中BTG3 mRNA表達(dá)與脈管癌栓、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中miR-106b、BTG3 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中miR-106b與BTG3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 胃癌組織中miR-106b表達(dá)與BTG3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.681，P=0.003)。

3 討論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我國(guó)胃癌的發(fā)病率和病死率均位居世界前列，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[9]。除飲食習(xí)慣、地域差異以及感染等因素外，表觀(guān)遺傳和多基因遺傳是導(dǎo)致胃癌發(fā)生和進(jìn)展的重要因素[10]。目前，臨床多采用手術(shù)聯(lián)合化療為主的綜合治療模式，其中化療主要包括術(shù)前新輔助化療和聯(lián)合靶向藥物治療，但是多項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明其療效仍較差[11]。近年來(lái)，日趨成熟的基因測(cè)序技術(shù)幫助人們深入認(rèn)識(shí)基因在疾病中的重要作用，miRNA、ErbB2以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA等的功能顛覆了人們的既往認(rèn)知。多項(xiàng)研究均表明，這些基因能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡且改變細(xì)胞周期;同時(shí)，這些基因的異常表達(dá)能夠?qū)е掳┌Y易感性增加[12,13]。

miRNA屬于非編碼RNA，可調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，并且能夠降解mRNA，在遺傳信息表達(dá)過(guò)程中起重要調(diào)控作用[14]。miR-106b-25基因簇位于染色體7q22 Mcm7基因內(nèi)含子13上，包括miR-106b、miR-25及miR-93三種基因，其中miR-106b在肺癌等多種惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)，參與各種癌細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中miR-106b的表達(dá)較癌旁正常組織升高。分析原因，可能由于癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)微小染色體維持蛋白7過(guò)度表達(dá)，激活原癌基因，最終直接促進(jìn)胃癌細(xì)胞中miR-106b表達(dá)提高[15,16]。本研究顯示，胃癌組織中miR-106b的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及脈管癌栓有關(guān)，表明miR-106b不僅能夠促進(jìn)胃癌進(jìn)展，而且可以反映胃癌的轉(zhuǎn)移情況，對(duì)評(píng)估患者病情具有重要意義。其機(jī)制可能為miR-106b能夠使Myc基因/轉(zhuǎn)錄因子E2F1/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生功能紊亂，抑制激酶抑制劑p21和促凋亡因子Bim，改變癌細(xì)胞的細(xì)胞周期且不斷累積受損DNA，最終促進(jìn)腫瘤的分化、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移[17]。

BTG3屬于B細(xì)胞遷移基因/ErbB2轉(zhuǎn)錄因子家族(BTG/Tob)，其N(xiāo)端通過(guò)結(jié)合E2F1蛋白，阻礙DP1和E2F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA，進(jìn)而使DNA合成受阻[7]。此外，BTG3能夠誘導(dǎo)Smad8蛋白和Smad4蛋白相互結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，BTG3蛋白的C端由于富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合Src蛋白，降低Src酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致Ras/MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路受阻，最終抑制細(xì)胞增殖、參與DNA損傷修復(fù)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[18]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中BTG3的表達(dá)量較癌旁正常組織低，其原因可能為癌細(xì)胞能夠分泌特異蛋白酶降解BTG3蛋白，同時(shí)，癌組織中BTG3自身啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)[19]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中BTG3表達(dá)與TNM分期和脈管癌栓有關(guān)，說(shuō)明BTG3可以參與胃癌發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能為BTG3能夠阻礙血漿蛋白酶原激活抑制劑1和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤血管形成、細(xì)胞增殖以及侵襲。同時(shí)，BTG3能夠抑制E2F1表達(dá)，進(jìn)而細(xì)胞有絲分裂和分化，而癌組織中BTG3表達(dá)下調(diào)，使其負(fù)性調(diào)控作用減弱，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及進(jìn)展[20]。

本研究結(jié)果表明，胃癌組織中miR-106b的表達(dá)與BTG3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明miR-106b和BTG3可能均在胃癌形成及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，且miR-106b可能負(fù)性調(diào)控BTG3，進(jìn)而影響胃癌進(jìn)程。既往研究[21]表明，非小細(xì)胞癌中miR-106b通過(guò)抑制BTG3表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。此外通過(guò)miR-106b抑制劑抑制其表達(dá)后，BTG3的表達(dá)量明顯提高，間接表明miR-106b對(duì)BTG3的負(fù)性調(diào)控作用。然而miR-106b的靶基因眾多，BTG3在胃癌組織中是否為miR-106b的靶點(diǎn)尚不明確，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，胃癌組織中miR-106b表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)TG3表達(dá)下調(diào)，二者均與腫瘤TNM分期和脈管癌栓有關(guān)，可能成為靶向藥物作用的新靶點(diǎn)。