胃癌組織中miR-181、miR-133a表達(dá)變化及意義

李偉，潘靜，陳曦

石家莊市第一醫(yī)院，石家莊050000

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。胃癌早期癥狀隱匿，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，錯失了最佳治療時(shí)期，導(dǎo)致患者5年總生存率低，預(yù)后較差[1]。目前臨床尚缺乏評估治療療效、預(yù)測患者預(yù)后的指標(biāo)，因此尋找能夠有效預(yù)測患者預(yù)后的生物標(biāo)志物是胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微小RNA(miR)是生物體內(nèi)一類長度約24個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，影響目的蛋白表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞生物學(xué)行為，大量研究證實(shí)，miR在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及惡性腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用[2]。miR-181是一類重要的miR，在急性髓系白血病[3]、黑色素瘤[4]、乳腺癌[5]等腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲及化療耐藥中均發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，miR-33a在結(jié)直腸癌[6]、胃癌[7]等惡性腫瘤中呈低表達(dá)狀態(tài)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能。本研究旨在通過檢測分析胃癌組織中miR-181、miR-133a表達(dá)，探討其臨床意義，以期為胃癌患者預(yù)后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年3月本院行切除術(shù)的胃癌患者113例，術(shù)中取其胃癌組織及癌旁(距離腫瘤邊緣>3 cm)正常組織樣本?；颊吣?3例，女40例；年齡<60歲64例，≥60歲49例；腫瘤直徑<5 cm 61例，≥5 cm 52例；腫瘤低分化43例，中高分化70例；浸潤深度為黏膜下層59例，漿膜層54例；病理類型為腺癌86例，印戒細(xì)胞癌21例，黏液癌6例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移61例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移52例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳ期37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療等抗腫瘤治療；均經(jīng)病理檢查確診為胃癌；有完整的病歷資料；完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他惡性腫瘤；肝腎等重要臟器功能不全；血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病；全身感染性疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-181、miR-133a表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)技術(shù)。將組織樣本至于研缽中，加入少量液氮進(jìn)行研磨，取70～80 mg組織樣本至EP管中，加入TRIzol溶液1 mL，用電動均漿器充分均漿，依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水，提取組織樣本中RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，RR037A)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Applied Biosystem SYBR 試劑盒(Thermo)進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。miR-181正向引物序列：5′-AACATTCAACGCTGTCGGTGAAGT-3′，反向引物序列：5′-ACTTCACCGACAGCGTTGAATGTT-3′；miR-133a正向引物序列：5′-ATAAGAATGCGGCCGCATTCCAAACTAGCAGCACTA-3′，反向引物序列：5′-AGCTTTGTTTAAACTTAACCATTCTAGCTTTTCC-3′；內(nèi)參U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATA-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 3 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt計(jì)算miR-181及miR-133a相對表達(dá)量。

1.3 隨訪 采用電子通訊、門診復(fù)查等方式對胃癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間從術(shù)后開始，隨訪至患者死亡或術(shù)后60個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-181、miR-133a表達(dá)比較 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-181相對表達(dá)量分別為4.593±0.987、1.312±0.367，miR-133a相對表達(dá)量分別為0.316±0.137、1.243±0.331。與癌旁正常組織相比，胃癌組織中miR-181相對表達(dá)量高，miR-133a相對表達(dá)量低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 胃癌組織中miR-181、miR-133a表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中miR-181表達(dá)與患者性別、年齡、病理類型無關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P均<0.05)；miR-133a表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、病理類型、TNM分期無關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織中miR-181、miR-133a表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中miR-181、miR-133a表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 以miR-181相對表達(dá)量中位數(shù)為界，將胃癌患者分為miR-181高表達(dá)組56例、miR-181低表達(dá)組57例。miR-181高表達(dá)組術(shù)后5年總生存率為32.14%(18/56)、中位生存時(shí)間為(33.21±2.69)個(gè)月；miR-181低表達(dá)組術(shù)后5年總生存率為56.14%(32/57)、中位生存時(shí)間為(47.60±2.28)個(gè)月。miR-181高表達(dá)組術(shù)后5年總生存率、中位生存時(shí)間均低于miR-181低表達(dá)組(P均<0.05)。

以miR-133a相對表達(dá)量中位數(shù)為界，將胃癌患者分為miR-133a高表達(dá)組56例、miR-133a低表達(dá)組57例。miR-133a低表達(dá)組術(shù)后5年總生存率為29.82%(17/57)、中位生存時(shí)間為(35.28±2.48)個(gè)月，miR-133a高表達(dá)組術(shù)后5年總生存率為58.93%(33/56)、中位生存時(shí)間為(45.85±2.72)個(gè)月。miR-133a低表達(dá)組術(shù)后5年總生存率、中位生存時(shí)間均低于miR-133a高表達(dá)組(P均<0.05)。

2.4 胃癌患者預(yù)后的影響因素 建立Cox比例回歸模型，以本研究資料為樣本，以預(yù)后生存狀況為應(yīng)變量，賦值生存=1，死亡=0，生存期=t。以前述單因素分析中P<0.10的指標(biāo)(因素)為自變量?；貧w過程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。結(jié)果顯示，影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素有浸潤深度(漿膜層)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期較高及miR-181高表達(dá)、miR-133a低表達(dá)(HR均>1，P均<0.05)。見表2。

表2 胃癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸模型多因素分析

3 討論

我國胃癌的發(fā)病率很高，且病死率居所有惡性腫瘤之首。據(jù)分析，我國未來幾年的胃癌發(fā)病人數(shù)還將隨著人口的老齡化而不斷增加[8]。盡管近年來醫(yī)療技術(shù)取得了飛速發(fā)展，但目前根治性手術(shù)仍然是治療胃癌的主要手段。然而許多患者就診時(shí)已錯過行根治手術(shù)的時(shí)機(jī)，且并非所有患者都適于采用根治性手術(shù)，如何早期診斷胃癌同時(shí)正確評估胃癌患者預(yù)后，能為正確決定患者臨床診療方案提供重要參考。因此迫切需要尋找有效評估胃癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

人類成熟miR-181家族包含miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d共4個(gè)成熟序列，其基因位于同一條染色體，且呈簇排列，協(xié)同參與靶基因調(diào)控[9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-181家族在維持造血細(xì)胞自我更新及定向分化等過程中具有重要調(diào)控作用[10]；miR-181可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡[11]；目前關(guān)于miR-181在胃癌發(fā)病及惡性進(jìn)展中的功能，尚存在較大爭議，如Hashimoto等[12]在胃癌細(xì)胞中增加miR-181c表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，揭示miR-181c通過抑制細(xì)胞增殖在胃癌進(jìn)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用；而余鈞輝等[13]發(fā)現(xiàn),在胃癌AGS細(xì)胞中上調(diào)miR-181a表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，具有促癌基因特性。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中miR-181相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，提示miR-181高表達(dá)可能是胃癌誘發(fā)因素之一，且參與并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程。研究證實(shí)，miR-181在非小細(xì)胞癌中靶向調(diào)控Bcl-2基因，抑制細(xì)胞增殖[14]；miR-181調(diào)控DAX-1基因表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖[15]，miR-181可能通過調(diào)控不同目的基因表達(dá)，在不同惡性腫瘤中發(fā)揮截然不同的生物學(xué)功能。本研究初步推測miR-181可能直接或間接參與相關(guān)基因(Cyclin B1、MMP等)的表達(dá)調(diào)控[16，17]，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展過程。后續(xù)將在分子細(xì)胞水平，對以上科學(xué)假設(shè)進(jìn)行研究和論證。

miR-133a是肌肉組織特異性表達(dá)的miRNA，其編碼基因包括miR-133a-1(位于18號染色體)和miR-133a-2(位于20號染色體)，兩者具有相同的成熟序列。近年來研究證實(shí)，miR-133a在惡性腫瘤中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，如miR-133a在乳腺癌中通過靶向負(fù)調(diào)控LASP1以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等作用[18]；而在結(jié)腸癌[19]中，miR-133a能夠抑制真核翻譯起始因子eIF4A1等基因表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的遷移，從而發(fā)揮抑癌基因功能。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-133a呈低表達(dá)狀態(tài)，且與胃癌腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與Dong等[20]在胃癌組織中針對miR-133a的研究結(jié)論一致。這些臨床病理特征均能夠反映胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的能力，與前述miR-133a在其他惡性腫瘤中的作用近似。此外，Chen等[21]進(jìn)行的體外研究也證實(shí)，miR-133a能夠通過調(diào)控PSEN1基因表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞EMT過程，而EMT的進(jìn)展與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此可推斷，miR-133a的表達(dá)異常與胃癌的發(fā)生相關(guān)；而抑制miR-133a的表達(dá)將促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的惡性程度，即miR-133a在胃癌的起病、進(jìn)展過程中起抑癌基因樣作用。

Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明，與miR-181低表達(dá)組、miR-133a高表達(dá)組相比，miR-181高表達(dá)組、miR-133a低表達(dá)組患者的預(yù)后均較差。提示miR-181、miR-133a具有預(yù)測胃癌患者預(yù)后的潛能。Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、較高TNM分期、miR-181高表達(dá)、miR-133a低表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，miR-181、miR-133a可能通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移等過程，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。檢測胃癌患者手術(shù)切除組織樣本中miR-181、miR-133a表達(dá)，有利于輔助評估患者預(yù)后。

綜上所述，胃癌組織中miR-181高表達(dá)、miR-133a低表達(dá)，且均與患者較差的臨床病理特征相關(guān)。miR-181高表達(dá)、miR-133a低表達(dá)患者的預(yù)后均較差，且均為影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。檢測患者手術(shù)切除組織中miR-181、miR-133a表達(dá)可能有利于患者預(yù)后的判斷。然而本研究為單中心研究，樣本較少，數(shù)據(jù)離散程度較大，可能導(dǎo)致miR-181、miR-133a表達(dá)與患者某些臨床病理特征的分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后續(xù)將進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行檢測和分析。