腸道菌群檢測與臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

吳培東

天津市第五中心醫(yī)院 （天津 300450）

1 檢測方法

1.1 細(xì)菌涂片與培養(yǎng)

細(xì)菌涂片是病原學(xué)診斷的經(jīng)典方法，也是最直接、最簡便、最快速的方法，但此方法對于種類繁多、數(shù)量龐大的腸道微生態(tài)系而言，僅可鑒定其中的1%，不能反映腸道微生物的真實情況，分析的結(jié)果與結(jié)論存在一定局限性。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)

1.2.1 針對16SrRNA、16SrDNA檢測

16SrRNA為原核生物的核糖體RNA，該基因在細(xì)菌各種屬之間既有高度保守的序列又有相互之間存在差異的堿基，且該基因種類少、豐度高（約占細(xì)菌RNA含量的80%）、分子大小適中，目前已廣泛用于腸道菌群種屬的鑒定，其缺點是只能鑒定已知菌群。原核生物核糖體小亞基16SrDNA，長度約1 500 bp，且其較16SrRNA穩(wěn)定，不易受污染降解，易于發(fā)現(xiàn)新的菌種。

1.2.2 多重PCR快速檢測

樣本同時被多對引物擴(kuò)增，腸道菌群的特有基因在電泳圖譜上得到顯示，從而達(dá)到鑒定的目的。

1.3 腸道菌群DNA指紋圖譜技術(shù)

該類技術(shù)主要包括9種：（1）傳統(tǒng)DNA指紋技術(shù)；（2）變性梯度凝膠電泳（DGGE）；（3）溫度梯度凝膠電泳（TGGE）；（4）PCR解鏈曲線分析技術(shù)（PCR melting profile）；（5）脈沖場凝膠電泳（PFGE）；（6）多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA）；（7）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）；（8）ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)；（9）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）。在以上方法中，PFGE在特異性、分辨性方面較理想，同時操作簡便，是目前細(xì)菌分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.4 分子探針技術(shù)及基因芯片技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）在鑒定腸道菌群方面有較多應(yīng)用，樣本中的基因在標(biāo)記特異寡聚核苷酸探針下，與已知腸道細(xì)菌的特異性DNA雜交，鑒定細(xì)菌種屬?；蛐酒夹g(shù)又稱DNA芯片，是固定的大量探針，標(biāo)記樣品與已知腸道細(xì)菌的特異性DNA雜交，通過檢測雜交信號，達(dá)到鑒定的目的。

截止到2018年8月，拉薩市印刷行業(yè)小微企業(yè)共計237戶。主要分布情況如下：布達(dá)拉宮——大昭寺商業(yè)圈從事印刷行業(yè)商戶共計59戶；西藏大學(xué)商業(yè)圈(江蘇路-藏大東路一線)47戶；柳梧新區(qū)商業(yè)圈36戶；拉薩市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)22戶。四個主要商業(yè)圈合計164戶，占據(jù)拉薩市印刷行業(yè)企業(yè)總數(shù)的69.20%。剩余企業(yè)則分散在拉薩市區(qū)周邊，尚未形成集聚現(xiàn)象。

1.5 腸道細(xì)菌的定量檢測技術(shù)

競爭性PCR技術(shù)，在模板中加入一種已知濃度的模板，組成2個PCR反應(yīng)，根據(jù)引物位置和條帶缺失，達(dá)到鑒定的目的。熒光定量PCR技術(shù)，是對反應(yīng)體系中產(chǎn)物熒光信號實時檢測的技術(shù)，用于腸道菌群基因分型、突變的鑒定。

2 臨床應(yīng)用

2.1 消化系統(tǒng)疾病

2.1.1 非酒精性脂肪肝

在對非酒精性脂肪肝患者與正常對照組的研究中發(fā)現(xiàn)，厚壁、變形菌屬的豐度增多，而擬桿菌屬則降低，同時整體腸道菌群的多樣性降低[2]。Liu等[3]通過給予SD大鼠不同類型的飲食發(fā)現(xiàn)，高脂肪和高糖飲食對非酒精性脂肪肝的誘導(dǎo)作用與熱量攝入無關(guān)，而與腸道菌群的變化有關(guān)，提示腸道菌群可能在非酒精性脂肪肝的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

2.1.2 肝硬化

有研究對肝硬化患者腸道菌群基因測序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、韋榮球菌、普氏菌菌屬的豐度增高，而擬桿菌屬豐度下降，共28種細(xì)菌關(guān)系緊密，今后可作為治療的觀察指標(biāo)[4]。

2.1.3 慢性便秘

研究顯示，成年便秘患者腸道內(nèi)雙歧桿菌、柔嫩梭菌、乳酸菌及產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌的含量明顯降低，而硫酸鹽還原細(xì)菌數(shù)量上升，利用16SrRNA高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，便秘患者腸道內(nèi)的普氏菌的豐度明顯降低，幾種代表性的厚壁菌豐度增加[5]。同時，有研究觀察到銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌等條件致病菌有所增加[6]。

2.2 代謝性疾病

2.2.1 肥胖

相對于正常體重者，肥胖者的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，擬桿菌屬的豐度下降，而厚壁菌屬豐度上升。

2.2.2 糖尿病

腸道菌群失衡可破壞正常能量儲存過程，且可產(chǎn)生細(xì)菌毒素，引起臟器炎癥，加重胰島素抵抗。1型糖尿病兒童，隨著時間及疾病的進(jìn)展，相對豐富的厚壁菌減少，擬桿菌增加，但與其年齡及HLA相匹配的健康兒童，厚壁菌相對增加，擬桿菌減少。2型糖尿病患者腸道厚壁菌屬比例降低，擬桿菌屬、大腸埃希菌等條件致病菌水平升高，雙歧桿菌等益生菌的含量明顯減少。Sato等[7]發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬中的一部分致病菌或條件致病菌的豐度增加。

2.2.3 骨代謝疾病

Yan等[8]在長達(dá)8個月的小鼠糞菌移植實驗中發(fā)現(xiàn)，微生物在糞菌移植初期會同時介導(dǎo)骨形成與骨吸收相關(guān)因子增加，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換暫時加快；隨著移植期變長，則對骨形成的影響占主導(dǎo)地位，促進(jìn)了小鼠長骨的縱向與徑向生長，使骨量趨于均衡，且發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與雌激素水平相關(guān)。Li等[9]發(fā)現(xiàn)腸道菌群主要通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)激素代謝及腸上皮營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運等途徑作用于骨骼系統(tǒng)。此外，腸上皮黏膜通透性改變也是引起小鼠去勢后骨量改變的機(jī)制之一。

2.3 自身免疫疾病

Miyake等[10]較早觀察到多發(fā)性硬化（MS）患者腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，MS患者梭狀芽孢菌屬、擬桿菌屬、普氏菌屬和薩特菌屬減少，這種變化在一定時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定。有研究顯示，炎癥性腸病帶狀皰疹的發(fā)病率比非炎癥性腸病高[11]。通過比較特應(yīng)性皮炎嬰兒與皮膚正常嬰兒的腸道菌群發(fā)現(xiàn)，前者含有較多的梭狀芽孢桿菌，而后者含有更多的雙歧桿菌和乳酸桿菌。

2.4 循環(huán)系統(tǒng)疾病

心血管疾病患者的腸道菌群與健康人的腸道菌群相比在數(shù)量上發(fā)生了較大的變化，心血管疾病患者的大腸桿菌、腸球菌、鏈球菌數(shù)量均比健康人升高，這些升高的組分多是條件致病菌和過路菌。在慢性心力衰竭患者的糞便中，腸道菌群的豐富度降低，如布勞特菌和柯林斯菌，而沙門菌、彎曲桿菌、志賀菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和念珠菌的數(shù)量增加[12]。張月和楊得振[13]研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者與非冠心病患者真菌、類桿菌屬、雙歧桿菌屬、普拉梭菌、乳酸桿菌屬、梭菌屬Ⅰ、叢生梭菌、梭狀芽孢桿菌、腸桿菌、腸球菌均存在顯著差異，急性心肌梗死患者乳酸桿菌、腸球菌下降明顯，腸桿菌升高明顯。

2.5 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

Keshavarzian等[14]在對帕金森病的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道菌群釋放的炎性物質(zhì)，使腸管通透性增加和細(xì)菌易位，造成腸道神經(jīng)系統(tǒng)損傷，引起帕金森病。Singh等[15]研究急性腦卒中對腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重腦卒中3 d后，腸道菌群的多樣性顯著降低，厚壁菌屬、擬桿菌屬和放線菌屬中特定細(xì)菌屬有所改變，這是腦卒中后微生物群失調(diào)的一個重要特征。游超等[16]通過對腦梗死患者及健康人糞便樣本提取的細(xì)菌DNA進(jìn)行16SrRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，腸桿菌、鏈球菌、韋榮球菌增加，擬桿菌、普氏菌減少。

2.6 腎臟疾病

在慢性腎臟病患者中，原有腸道菌表現(xiàn)為益生菌比例減少而產(chǎn)毒素菌群增加。有研究發(fā)現(xiàn)，短狀桿菌、鹽單胞菌科、莫拉氏菌、腸桿菌、假單胞菌增加，乳酸桿菌和普氏菌下降[17]。

2.7 精神疾病

有研究發(fā)現(xiàn)，胃腸功能紊亂、炎性腸病、抑郁癥、自閉癥患者均存在腸道菌群改變。有動物實驗表明，處于長期受壓狀態(tài)的小鼠，腸桿菌減少，梭菌屬增多[18]。

2.8 腫瘤

在對胃癌患者腸道菌群的研究中發(fā)現(xiàn)，厚壁菌、擬桿菌、梭桿菌、放線菌減少，而螺桿菌增加，胃炎患者沒有以上表現(xiàn)[19]。

3 小結(jié)

腸道菌群與人體的關(guān)系密切，在一些疾病中有一定的特定變化。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步、發(fā)展，腸道菌群檢測將很快得到開展并服務(wù)于臨床工作，為疾病的診斷與治療提供新的方法。