非標(biāo)記表面增強(qiáng)拉曼光譜在病原菌檢測中的應(yīng)用

李佳，沈瀚，顧兵

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008；2.徐州醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 徐州 221002；3.徐州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，徐州市實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221002

據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有超過3億例由細(xì)菌感染引起的致命性疾病，造成200多萬人喪失生命[1]。如果細(xì)菌感染可以在早期階段得到有效治療，那么存活率可以大大提高[2]。因此，臨床上迫切需要快速、靈敏和成本較低的檢測致病菌的技術(shù)。目前，我國臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原菌的檢測仍依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，包括在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)、對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行形態(tài)分析，以及進(jìn)行細(xì)菌代謝物的測定，一般需要3～5 d才能出報(bào)告，耗時(shí)耗力[3]。近年來隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因芯片、質(zhì)譜技術(shù)以及二代測序技術(shù)作為傳統(tǒng)檢測方法的補(bǔ)充，在病原菌的鑒定與藥敏試驗(yàn)中得到了一些探索與應(yīng)用，但仍存在不少問題，離臨床應(yīng)用距離較遠(yuǎn)?；蛐酒夹g(shù)雖然具有高通量、快速和自動(dòng)化的優(yōu)勢，但儀器設(shè)備成本昂貴而難以用于臨床[4]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）是目前逐步用于臨床微生物快速鑒定的革命性技術(shù)，遺憾的是該技術(shù)不能用于病原菌的藥敏檢測，且儀器價(jià)格昂貴在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用[5]。二代測序技術(shù)也是目前細(xì)菌鑒定和耐藥性分析的有力工具，但成本較高，且目前生物信息學(xué)人才缺乏，面對(duì)海量信息的測序結(jié)果，難以短時(shí)間內(nèi)得到正確可靠的分析結(jié)果，限制了測序技術(shù)在臨床的推廣[5-6]。因此，非常需要研發(fā)一種速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的臨床病原菌檢測方法[7]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有靈敏度高、檢測速度快、成本較低和方便攜帶等很多優(yōu)點(diǎn)[8-9]，從而在化學(xué)和生物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[10-13]。早在1989年，Holt和Cotton就首次對(duì)細(xì)菌的SERS圖譜進(jìn)行了報(bào)道[14]。4年之后，Magee教授又提出利用整個(gè)生物體的指紋譜圖譜對(duì)病原菌進(jìn)行檢測是完全有可能實(shí)現(xiàn)的[15]。此后，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌、蠟樣芽孢桿菌及傷寒沙門菌等細(xì)菌的指紋譜及基于SERS檢測細(xì)菌的新方法被相繼報(bào)道[16-19]?？梢?，SERS為病原菌的快速檢測打開了新的大門。菌體表面成分復(fù)雜，含有多種生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類、多糖等，普通的分析方法很難對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位及無損檢測。SERS的高靈敏及指紋譜等特點(diǎn)可以滿足病原微生物檢測快速、準(zhǔn)確的要求。

1 SERS的基本理論

1928年，印度科學(xué)家拉曼（Raman）首次發(fā)現(xiàn)了拉曼散射現(xiàn)象，其攜帶的分子結(jié)構(gòu)信息，能直觀地為分子的振動(dòng)、化學(xué)鍵、基團(tuán)的研究提供檢測手段，因此是一種表征分子結(jié)構(gòu)振動(dòng)的非彈性散射光譜。然而，信號(hào)弱這一缺點(diǎn)限制了拉曼光譜的實(shí)際應(yīng)用。直到1974年，F(xiàn)leischmann等發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙銀電極表面的吡啶分子的拉曼信號(hào)得到極大提高，這個(gè)現(xiàn)象稱為SERS[20]。與其他光譜檢測方法相比，SERS具有如下明顯優(yōu)勢：SERS提供物質(zhì)分子獨(dú)特的指紋譜信息以實(shí)現(xiàn)未知物的定性定量檢測；SERS檢測靈敏度很高，理想情況下SERS增強(qiáng)因子可達(dá)到1010～1014，可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測[21-22]；SERS譜帶較窄，譜峰分辨率高，可以有效避免熒光背景干擾，適用于多組分同時(shí)探測；SERS檢測對(duì)樣品要求低，固相、液相和氣相的樣品都可以檢測。

SERS的增強(qiáng)主要有2個(gè)機(jī)制，即電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)[23]。普遍認(rèn)為遠(yuǎn)程電磁增強(qiáng)和短程化學(xué)增強(qiáng)效應(yīng)對(duì)放大拉曼信號(hào)同時(shí)起作用[24]。通常，電磁增強(qiáng)的增強(qiáng)因子被認(rèn)為是106～108的量級(jí)，而化學(xué)增強(qiáng)的增強(qiáng)因子只能是102量級(jí)。化學(xué)增強(qiáng)，即分子在貴金屬粗糙表面的某些位點(diǎn)被吸收，來自分子的電子與來自金屬表面的電子相互作用，產(chǎn)生與共振拉曼散射類似的增強(qiáng)效應(yīng)[25]。由于增強(qiáng)底物、吸附分子和相互吸附位點(diǎn)不同，化學(xué)增強(qiáng)產(chǎn)生的SERS增強(qiáng)效果也不同[26]。與化學(xué)增強(qiáng)相比，由局域表面等離子體共振的激發(fā)引起的電磁機(jī)制增強(qiáng)被認(rèn)為是產(chǎn)生SERS現(xiàn)象的主要原因[27]。傳導(dǎo)電子的振蕩可以發(fā)生在貴金屬納米顆粒、尖銳的金屬尖端或粗糙的金屬表面，在這個(gè)過程中，它可以導(dǎo)致局部電磁場的重新分布，使得貴金屬納米顆粒周圍特定位置的電磁場的大幅增強(qiáng)[28]。這種增強(qiáng)具有很強(qiáng)的距離依賴性，距離的微小減小可以導(dǎo)致強(qiáng)度的顯著提高，只有分子非常接近金屬表面才可以產(chǎn)生巨大的場強(qiáng)。因此，SERS檢測成功的關(guān)鍵是使待測物質(zhì)與SERS底物表面盡量接觸盡可能多的點(diǎn)。

2 非標(biāo)記SERS法用于病原菌檢測

非標(biāo)記SERS方法具有較高的靈敏度和豐富的光譜特征，這些特點(diǎn)為細(xì)菌檢測提供了新的研究方向[29]。現(xiàn)有研究缺乏SERS譜帶歸屬的匯總或相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，因此，大多數(shù)基于非標(biāo)記SERS的研究重點(diǎn)是解釋細(xì)菌的SERS并進(jìn)行SERS檢測病原菌新方法的探索。

Jarvis等通過體內(nèi)還原靠近細(xì)胞內(nèi)膜的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Au（Ⅲ），首次報(bào)道了來自細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)的SERS信號(hào)[30]。在拉曼位移為1250 cm-1處的SERS峰的產(chǎn)生與細(xì)胞膜和胞質(zhì)蛋白相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)SERS峰主要來源于細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，如核酸、蛋白質(zhì)、多糖、碳水化合物和脂質(zhì)以及復(fù)雜的分子聚合物[31]，SERS增強(qiáng)機(jī)制中的距離依賴性也支持這一假說。拉曼位移在 624、652、735、955、1330和1456 cm-1處的SERS譜峰主要來自細(xì)胞壁。拉曼位移在735和1330 cm-1處的SERS譜峰是腺嘌呤或單磷酸腺苷的典型特征[32]，可以更準(zhǔn)確地歸屬于腺嘌呤的平面環(huán)狀呼吸模式或來自其他含腺嘌呤分子（FAD、NAD等）以及嘌呤部分的不同產(chǎn)物[33]。拉曼位移為735和1130 cm-1處的峰歸屬于變性DNA，這也證明了Ag納米球（Ag NSs）和細(xì)菌細(xì)胞壁之間結(jié)合緊密。所有細(xì)菌在給定的光譜區(qū)域520和1050 cm-1中有相似的峰，其中某些峰的強(qiáng)度存在一些差異。細(xì)菌的SERS提供了分子結(jié)構(gòu)、細(xì)胞成分和生理狀態(tài)特征，可用于區(qū)分不同菌種或區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌[34-35]。例如，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在拉曼位移1128～1388 cm-1范圍內(nèi)，可以看出SERS的明顯差異。來源于蛋白質(zhì)CH變形的拉曼位移為1330 cm-1處的SERS峰強(qiáng)度表明革蘭陰性菌的細(xì)胞壁含有比革蘭陽性菌更多的蛋白質(zhì)[36]。用SERS比較死細(xì)菌和活細(xì)菌時(shí)，SERS的不同可能是由于死細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的破裂所致[37]。

主要用于細(xì)菌檢測的非標(biāo)記SERS方法是通過將貴金屬納米顆粒和溶液中細(xì)菌混合或者通過在細(xì)菌附著的增強(qiáng)基底上形成一層納米粒子薄膜。只有當(dāng)基底具有可重復(fù)性并且能提供高度增強(qiáng)SERS信號(hào)時(shí)，才能成功檢測細(xì)菌。

Wang等發(fā)明了一種新型單分散Ag NSs的SERS基底，其具有由Ag納米晶體（Ag NCs）組裝形成的熱點(diǎn)，用于區(qū)分3種病原菌（大腸桿菌O157、傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌）以及區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌[38]。由Xu等發(fā)明的準(zhǔn)三維等離子體納米結(jié)構(gòu)陣列構(gòu)成的SERS基底，可用于快速檢測7種臨床上和環(huán)境中常見的副溶血性弧菌菌株。上述2項(xiàng)研究均成功地鑒定了病原菌，但沒有理想的定量結(jié)果[39]。

萬古霉素是一種抗生素，可以通過細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖和萬古霉素的羰基和胺基之間形成氫鍵，緊密結(jié)合細(xì)菌，增加細(xì)菌對(duì)納米金屬表面的黏附可以使檢測限大大提高[40]。萬古霉素可以將一小部分細(xì)胞壁與SERS基底之間距離拉近，形成熱點(diǎn)，從而導(dǎo)致SERS信號(hào)大大增強(qiáng)[41]。萬古霉素修飾的Ag NRs可以更容易地捕獲革蘭陽性細(xì)菌[42]，研究發(fā)現(xiàn)萬古霉素包被的Ag-Au基底對(duì)革蘭陰性和革蘭陽性菌的SERS增強(qiáng)效果比沒有被萬古霉素或頭孢他啶水合物包被的基底增強(qiáng)效果更好，還可以排除血液成分的干擾[43]。雖然基于納米金屬表面的SERS增強(qiáng)方法可以提供病原菌相對(duì)穩(wěn)定和可重現(xiàn)的SERS信號(hào)，但復(fù)雜的合成和較高的成本限制了其應(yīng)用。

與上述納米金屬表面相比，貴金屬納米顆粒更容易合成，因此應(yīng)用更加廣泛。通常使用膠體金、膠體銀與細(xì)菌簡單混合進(jìn)行非標(biāo)記SERS檢測[44]，但所產(chǎn)生的混合物可能會(huì)導(dǎo)致納米顆粒在病原菌表面隨機(jī)分布，使得SRES的重現(xiàn)性差。由于革蘭陰性和革蘭陽性菌的細(xì)胞壁分別存在脂多糖或磷壁酸而帶負(fù)電，因而可以通過靜電吸引力使納米顆粒沉積在細(xì)菌細(xì)胞壁上。例如，Kahraman等報(bào)道了聚丙烯氯化銨（PAH）/Au NPs/PAH逐層結(jié)構(gòu)，其可以通過靜電相互作用高效且精確地沉積在細(xì)菌細(xì)胞壁上，用于單個(gè)細(xì)菌的SERS檢測[45]，但這一方法步驟復(fù)雜且無法實(shí)現(xiàn)定量。原位合成法可以保證納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞壁的均勻接觸。Zhou等提出通過靜電作用在細(xì)菌細(xì)胞壁上原位合成Ag NPs，從而更好地對(duì)飲用水中的細(xì)菌進(jìn)行SERS檢測[46]。使用這種方法增強(qiáng)細(xì)菌的拉曼信號(hào)比膠體和細(xì)菌簡單混合的懸浮液得到的SERS信號(hào)要強(qiáng)很多[47]，此方法對(duì)水中病原菌細(xì)胞的最低檢測限為2.5×102/mL。此外，我們發(fā)現(xiàn)Ag NPs合成后細(xì)菌的拉曼信號(hào)強(qiáng)度主要取決于細(xì)胞壁的Zeta電位。此外，我們研究了這種方法用于區(qū)分野生型菌株和抗生素耐藥突變菌株的機(jī)制，以及通過SERS圖譜對(duì)活細(xì)菌和死細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)[48]，結(jié)果表明電荷似乎只與細(xì)菌表面Ag NPs的重新合成有關(guān)，而與它們的持續(xù)附著無關(guān)。這一方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如操作簡單、反應(yīng)物體積較小、靈敏度和選擇性高，以及良好的重現(xiàn)性，可以應(yīng)用到更復(fù)雜的樣品如食品或血液樣品中。

盡管目前通過SERS增強(qiáng)基底直接增強(qiáng)純培養(yǎng)的細(xì)菌來獲得目標(biāo)菌的SERS指紋圖譜并進(jìn)行聚類分析的方法有很多報(bào)道，但直接對(duì)臨床樣本中的病原菌進(jìn)行快速SERS檢測的研究仍有很多困難。臨床樣本組成較為復(fù)雜，而普通SERS增強(qiáng)基底缺乏選擇性，實(shí)際樣本中的雜質(zhì)信號(hào)會(huì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)細(xì)菌的SERS信號(hào)。針對(duì)這一難點(diǎn)，研究人員提出了一種利用廣譜生物識(shí)別分子修飾的SERS基底，從復(fù)雜樣本中分離、純化細(xì)菌后，直接檢測其SERS指紋譜信號(hào)的新方法。如2011年，王玉麟等報(bào)道了萬古霉素修飾的固態(tài)納米銀基底可以從血液中捕獲多種病原菌[49]。2014年，何耀等利用巰基苯硼酸修飾的硅基銀基底在血液中直接捕獲并檢測了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[50]。2016年，王升啟等報(bào)道了一種利用聚乙烯亞胺修飾的金殼磁珠能夠快速捕獲、富集并直接增強(qiáng)出病原菌的拉曼信號(hào)，用該方法在牛奶等復(fù)雜溶液中檢測細(xì)菌只需15 min，檢測限為1000 CFU/mL[51]。上述基于修飾的SERS基底指紋譜檢測病原菌的方法具有快速檢測實(shí)際樣本中病原菌的潛力，但檢測靈敏度還較差（＞500 CFU/mL），并且無法區(qū)分混合菌群。

3 結(jié)語

以上我們總結(jié)了近年來非標(biāo)記表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測病原菌的進(jìn)展。大量研究表明，通過合理構(gòu)建基于非標(biāo)記的SERS檢測體系，將SERS技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合，即具有實(shí)現(xiàn)快速檢測病原菌的強(qiáng)大潛力。然而非標(biāo)記SERS檢測病原菌仍存在很多問題。例如，納米材料的增強(qiáng)作用在不同位點(diǎn)是不同的，粒子之間距離越近，偶合和增強(qiáng)效應(yīng)就越強(qiáng)，反之增強(qiáng)效應(yīng)就越弱，因此，SERS技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵在于制備出均勻、穩(wěn)定和可重現(xiàn)性好的增強(qiáng)基底；SERS直接檢測在復(fù)雜體系中極易受到干擾信息的影響，因此，提高檢測方法的選擇性，是SERS技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際復(fù)雜檢測體系的關(guān)鍵；所獲SERS圖譜的分析目前還做不到一鍵式，需要后期處理；科研人員還須構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，使SERS成為檢測病原菌的常規(guī)項(xiàng)目，并建立相應(yīng)的病原菌數(shù)據(jù)庫以實(shí)現(xiàn)病原菌快速鑒定。