單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在肝臟疾病研究中的應(yīng)用

王煜鵬，楊揚(yáng)，王學(xué)軍，周喆，王升啟

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

肝臟作為中樞代謝協(xié)調(diào)器，具有廣泛的基本功能，包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成和膽汁合成。此外，當(dāng)肝臟受到損傷后，具有一定程度的自我更新和修復(fù)能力。近幾十年來(lái)，肝臟疾病一直是全世界最為關(guān)注的人類健康問(wèn)題之一，研究發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)肝臟疾病的發(fā)生率和死亡率均呈顯著上升趨勢(shì)[1]。近年來(lái)盡管人類在肝病治療領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展，但因其全球患病率高、長(zhǎng)期臨床療效差、致病因素多且臨床上常同時(shí)出現(xiàn)多種表型，所以目前在提高肝病患者治愈率及生存率方面仍然收效甚微[2]。因此，迫切需要提高對(duì)各種肝病復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)，以幫助獲得更準(zhǔn)確的疾病亞型，用于個(gè)性化治療。

細(xì)胞是人體中最小的結(jié)構(gòu)和功能單元，每個(gè)功能單元都有不同的來(lái)源和背景，它不僅存在于不同生物體中，而且存在于同一個(gè)生物體的不同器官和組織中[3-4]。肝臟中的細(xì)胞種類較為豐富，包括肝細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞、膽管細(xì)胞以及各種免疫細(xì)胞。在肝炎、肝纖維化或肝癌等肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，即使同一類細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)等都會(huì)發(fā)生變化甚至?xí)只a(chǎn)生新的細(xì)胞亞型，導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步惡化和轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的研究技術(shù)和方法往往要從大量細(xì)胞中提取DNA、RNA或蛋白質(zhì)，得到的是這些細(xì)胞的整體表征，很多重要的低豐度細(xì)胞的顯著差異信息會(huì)被丟失，這可能會(huì)直接影響病情的正確評(píng)估和治療方案的正確選擇。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)作為一項(xiàng)新興技術(shù)，一經(jīng)推出就受到廣泛關(guān)注，并在過(guò)去幾年得到迅速發(fā)展。它可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)研究技術(shù)和方法的不足，在單細(xì)胞分辨率水平展示肝臟的全面視圖，概述肝臟中駐留細(xì)胞的特征，特別是提供肝臟免疫微環(huán)境的圖譜，在理解肝臟細(xì)胞發(fā)育軌跡、表征組織內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性、分析基因表達(dá)差異方面展現(xiàn)出了前所未有的優(yōu)勢(shì)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的蓬勃發(fā)展為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、癌癥學(xué)等研究領(lǐng)域帶來(lái)了一場(chǎng)空前革命，為眾多可能性打開了大門[5-8]。本文將主要闡述單細(xì)胞測(cè)序及其在肝臟疾病研究中的應(yīng)用。

1 單細(xì)胞測(cè)序方法分類

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展至今得到了廣泛的拓展和研究，下面對(duì)當(dāng)前已有的單細(xì)胞測(cè)序方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1.1 單細(xì)胞基因組測(cè)序

單細(xì)胞DNA測(cè)序（scDNA-seq）作為在單細(xì)胞水平上對(duì)細(xì)胞全基因組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序的一項(xiàng)技術(shù)，需要對(duì)分離出的單細(xì)胞微量基因組進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）。為了確保無(wú)偏倚的高基因組覆蓋率，自單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)誕生后近20年來(lái)，WGA技術(shù)發(fā)生了幾次重大變革。WGA主要有3種方式，即簡(jiǎn)并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(yīng)（degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction，DOP-PCR）[9]、多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）[10]和基于多個(gè)退火和循環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）[11]。盡管 WGA 可以提高 scDNA-seq的敏感性，但單細(xì)胞DNA研究主要聚焦拷貝數(shù)變異（CNV），因?yàn)闇?zhǔn)確鑒定CNV要求相當(dāng)高的敏感性，所以目前仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。

1.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通常稱為單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），用于解析復(fù)雜生物系統(tǒng)中單細(xì)胞水平的細(xì)胞類型差異和基因表達(dá)譜，在定義新的細(xì)胞類型、發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物以及分析和理解細(xì)胞異質(zhì)性方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。單細(xì)胞RNA測(cè)序比單細(xì)胞DNA測(cè)序更容易實(shí)施，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞都包含許多RNA分子，但DNA分子拷貝數(shù)卻極少[12]。進(jìn)行常規(guī)基因表達(dá)分析時(shí)，一般選擇基因的3'端測(cè)序，而當(dāng)進(jìn)行免疫克隆以及T細(xì)胞受體（TCR）和B細(xì)胞受體（BCR）相關(guān)研究時(shí)，則應(yīng)選擇5'端測(cè)序。5'端測(cè)序會(huì)進(jìn)行V（D）J全長(zhǎng)片段的組裝和注釋，對(duì)單個(gè)T細(xì)胞TCR的α和β鏈序列進(jìn)行匹配，以及對(duì)單個(gè)B細(xì)胞的BCR輕鏈和重鏈序列的匹配，這對(duì)于探索適應(yīng)性免疫系統(tǒng)具有重要意義。

1.3 單細(xì)胞DNA甲基化測(cè)序

在正常細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，DNA甲基化是許多物種中重要的表觀遺傳標(biāo)記，它作為化學(xué)或蛋白質(zhì)標(biāo)簽存在于DNA序列中。這種標(biāo)簽在不改變現(xiàn)有DNA序列的基礎(chǔ)上，時(shí)刻記錄著細(xì)胞的發(fā)育變化過(guò)程，參與決定生物學(xué)調(diào)控過(guò)程的開啟或關(guān)閉，控制細(xì)胞的命運(yùn)。之前對(duì)于DNA甲基化的研究是建立在大量細(xì)胞的整體測(cè)量上，這掩蓋了細(xì)胞之間的差異以及一些稀有細(xì)胞類型的影響。因此，在單個(gè)細(xì)胞中測(cè)量DNA甲基化的能力可能對(duì)理解幾個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程（例如胚胎發(fā)育、疾病進(jìn)展和衰老）做出重要貢獻(xiàn)[13]。

1.4 單細(xì)胞組蛋白修飾測(cè)序

組蛋白修飾可調(diào)節(jié)某些特定DNA區(qū)域的親和力和可及性。為了解析組蛋白修飾在不同細(xì)胞中的作用，先后開發(fā)了單細(xì)胞染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（single-cell chromatin immunoprecipitation sequencing，scChIP-seq）[14]、測(cè)序后單細(xì)胞染色質(zhì)整合標(biāo)記（single-cell chromatin integration labeling followed by sequencing，scChIL-seq）[15]、靶向性和標(biāo)簽化的單細(xì)胞裂解（single-cell cleavage undertargets and tagmentation，scCUT＆Tag）[16]以及單細(xì)胞染色質(zhì)免疫切割然后測(cè)序（single-cell chromatinimmune-cleavage followed by sequencing，sc-ChIC-seq）[17]等4種方法。這些先進(jìn)的單細(xì)胞技術(shù)可以在一些不能僅通過(guò)轉(zhuǎn)錄組來(lái)分析細(xì)胞的情況下，揭示表觀遺傳異質(zhì)性的各個(gè)方面，有望在癌癥基因組學(xué)和相關(guān)轉(zhuǎn)化研究中得到更多應(yīng)用。

1.5 單細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)序

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在胚胎發(fā)育、分化及疾病發(fā)展中起核心作用。對(duì)轉(zhuǎn)座酶核可及的染色質(zhì)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序（single-cell sequencing for transposase accessible chromatin，scATAC-seq），即是以在功能上鑒定細(xì)胞中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的相關(guān)變化為目的的一項(xiàng)解決方案。使用scATAC-seq，讓研究者能夠通過(guò)識(shí)別每個(gè)細(xì)胞中開放染色質(zhì)位點(diǎn)的基因組位置的變異性，從而洞悉由其他相同的DNA序列產(chǎn)生的細(xì)胞間變異性，觀察染色質(zhì)致密化和DNA結(jié)合蛋白如何精準(zhǔn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，達(dá)到補(bǔ)充單細(xì)胞DNA和RNA測(cè)序獲得的DNA拷貝數(shù)變異和RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的目的，在功能上鑒定癌細(xì)胞特定亞群中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的相關(guān)變化是其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[18]。

1.6 單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展日益成熟的環(huán)境下，基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。它將Visium空間內(nèi)視技術(shù)與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相結(jié)合，產(chǎn)生了Visium Spatial基因表達(dá)解決方案。使用這一方案，可測(cè)量組織切片中的總mRNA，并且只需要帶有完整組織切片的Visium Spatial玻片作為輸入，將細(xì)胞中基因的表達(dá)無(wú)偏離地對(duì)應(yīng)在組織切片上，為我們提供以前無(wú)法獲得的組織生物學(xué)觀點(diǎn)。但為了保證mRNA轉(zhuǎn)錄本的完整性以及保持組織切片的形態(tài)質(zhì)量，正確的組織處理和制備技術(shù)對(duì)于此方案極為重要。這一方法的出現(xiàn)，使以往難以解離的組織，以及一些數(shù)量稀少且極易發(fā)生應(yīng)激死亡的細(xì)胞類型，有了以單細(xì)胞水平探索轉(zhuǎn)錄組的可能。

2 單細(xì)胞測(cè)序在肝臟生理功能研究中的應(yīng)用

肝臟作為代謝和免疫反應(yīng)發(fā)生的主要場(chǎng)所之一，是人體中體積最大的器官。然而，關(guān)于組成肝臟及其免疫微環(huán)境的細(xì)胞知之甚少。因此，以單細(xì)胞分辨率展示肝臟的全面視圖，概述肝臟中駐留細(xì)胞的特征，特別是提供肝臟免疫微環(huán)境的細(xì)胞圖譜，對(duì)于了解肝病的發(fā)病機(jī)理和治療至關(guān)重要。2017年，Halpern等[19]利用單分子熒光原位雜交（single molecule fluorescencein situhybridization，smFISH）與單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，首次對(duì)小鼠的整個(gè)肝臟單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行了研究，這使人們更充分地意識(shí)到肝臟中細(xì)胞的高度異質(zhì)性以及區(qū)域特性，在細(xì)胞層面上對(duì)健康肝臟組織生理加深了理解。之后，MacParland等[20]通過(guò)對(duì)5個(gè)人類新鮮肝組織的分離獲得的8444個(gè)實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，揭示了不同的肝內(nèi)巨噬細(xì)胞群體，即存在2種不同的肝內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞種群，分別具有促進(jìn)炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能。這為更精確地了解肝內(nèi)巨噬細(xì)胞亞群在肝病發(fā)生和發(fā)展中的作用以及開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)療法提供了參考。隨后，在肝臟的細(xì)胞組成仍然知之甚少的情況下，Aizarani等[21]對(duì)來(lái)自9位人類供體正常肝臟中的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，以構(gòu)建人類肝臟細(xì)胞圖集。通過(guò)分析確定了內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞和肝細(xì)胞先前未知的亞型，揭示了肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的區(qū)域劃分，并發(fā)現(xiàn)不同類型的肝細(xì)胞可能協(xié)同執(zhí)行基本功能。這份人類肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜為發(fā)現(xiàn)正常和患病的肝臟中以前未知的細(xì)胞類型提供了強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支持。針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，Halpern等[22]在普通單細(xì)胞測(cè)序基礎(chǔ)上開發(fā)了配對(duì)細(xì)胞RNA測(cè)序（paired cell RNA sequencing，pcRNAseq），分析肝細(xì)胞及相鄰肝內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)，并利用肝細(xì)胞標(biāo)記基因確定其在組織中的定位，以高空間分辨率解決了肝內(nèi)皮細(xì)胞基因的空間分區(qū)模式。同時(shí)，Gravina等[23]采用單細(xì)胞DNA甲基化組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟內(nèi)全基因組5-甲基胞嘧啶（5mC）模式具有高度異質(zhì)性，DNA甲基化模式中的表觀突變頻率比體細(xì)胞突變頻率高至少2個(gè)數(shù)量級(jí)。

在對(duì)成熟肝臟的生理有了一定了解之后，以單細(xì)胞分辨率探究肝臟的發(fā)育過(guò)程也逐漸取得成果。Su等[24]采用無(wú)標(biāo)記scRNA-seq技術(shù)分析了小鼠肝臟發(fā)育過(guò)程中從胚胎11.5 d到出生后2.5 d的7個(gè)時(shí)期中隨機(jī)選擇的507個(gè)細(xì)胞和出生后3.25 d小鼠肝臟中52個(gè)Epcam陽(yáng)性的膽管細(xì)胞的綜合轉(zhuǎn)錄譜，揭示了小鼠肝臟發(fā)育的動(dòng)態(tài)軌跡，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間的異質(zhì)性存在于肝臟發(fā)育的各個(gè)階段和病理狀態(tài)。同樣針對(duì)肝臟發(fā)育，Segal等[25]利用scRNA-seq技術(shù)，以單細(xì)胞分辨率探索人類胎兒和成年肝臟的轉(zhuǎn)錄組，在人類胎兒肝臟中發(fā)現(xiàn)了肝膽雙能祖細(xì)胞（HHyP）的存在，這為胚胎發(fā)育、體內(nèi)平衡或肝臟受損修復(fù)過(guò)程中人類肝實(shí)質(zhì)組織細(xì)胞的起源給出了答案。

3 單細(xì)胞測(cè)序在肝臟炎癥反應(yīng)和肝損傷研究中的應(yīng)用

此前的研究表明，炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展與免疫細(xì)胞的募集和浸潤(rùn)有關(guān)，但在慢性疾病期間免疫細(xì)胞如何對(duì)肝臟中發(fā)生的炎癥和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)做出反應(yīng)還不得而知。Tamburini等[26]使用單細(xì)胞RNA測(cè)序和多光譜免疫熒光分析，證明了慢性肝病患者的淋巴管豐度增加，并且與纖維化和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域相關(guān)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）在慢性肝病發(fā)展過(guò)程中會(huì)加快增殖，以維持組織穩(wěn)態(tài)。但是，當(dāng)在脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）狀態(tài)下的氧化型低密度脂蛋白等炎癥信號(hào)增加時(shí)，淋巴功能下降，肝動(dòng)態(tài)平衡受損。

在肥胖相關(guān)的非酒精性脂肪肝疾病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)展為脂肪性肝炎的過(guò)程中，肝臟和骨髓中的免疫細(xì)胞功能必定會(huì)受到影響發(fā)生變化。因此，深入表征脂肪肝中免疫細(xì)胞的功能適應(yīng)性就極為必要。Krenkel等[27]利用單細(xì)胞RNA測(cè)序全面評(píng)估了非酒精性脂肪肝疾病期間肝臟和骨髓中髓樣細(xì)胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)肝和骨髓中存在不同的髓樣細(xì)胞簇。同時(shí)，肝髓樣區(qū)在NAFLD進(jìn)展過(guò)程中逐漸適應(yīng)了獨(dú)特的炎癥表型，并且肝臟和骨髓中的髓樣細(xì)胞具有功能上獨(dú)特的炎癥表型，其典型特征是巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞亞群中的炎癥鈣結(jié)合蛋白基因（S100A8/A9）表達(dá)下調(diào)。這為進(jìn)一步了解脂肪性肝炎打下了基礎(chǔ)。Xiong等[28]對(duì)健康和脂肪性肝炎小鼠肝臟細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)在脂肪性肝炎的肝臟中出現(xiàn)了與脂肪性肝炎相關(guān)的巨噬細(xì)胞（NASH-associatedmacrophages，NAM），并且其對(duì)藥理反應(yīng)高度敏感。將其作為小鼠和人類脂肪性肝炎的標(biāo)志，是我們了解、治療和預(yù)防脂肪性肝炎的重要理論依據(jù)。

肝臟是人體最大的實(shí)體器官，肝臟損傷會(huì)導(dǎo)致一連串的炎癥事件。為了在單細(xì)胞水平上更深入了解肝臟受損狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組信息，Chang等[29]利用單細(xì)胞RNA測(cè)序探索肝膽汁淤積性損傷期間肝細(xì)胞亞型和獨(dú)特功能，發(fā)現(xiàn)肝損傷期間表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)基因的肝細(xì)胞可能經(jīng)歷了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)，膽汁淤積性肝細(xì)胞的4個(gè)簇（BDL-2、BDL-3、BDL-4和 BDL-5）以炎癥調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等不同方式參與了炎癥過(guò)程。這些結(jié)果提供了更多對(duì)受損肝中肝細(xì)胞獨(dú)特功能的認(rèn)識(shí)，對(duì)肝細(xì)胞的未來(lái)優(yōu)化治療提供了理論依據(jù)。肝臟主要的上皮細(xì)胞如肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞（biliary epithelial cells，BEC）等在肝損傷再生過(guò)程中起重要作用，Pepe-Mooney等[30]使用單細(xì)胞RNA測(cè)序檢查了肝臟組織穩(wěn)態(tài)時(shí)和損傷后的膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)時(shí)膽管上皮細(xì)胞有著顯著的異質(zhì)性，反映了YAP信號(hào)依賴性程序的激活，而YAP信號(hào)是肝細(xì)胞在損傷后重編程為膽管祖細(xì)胞所必需的，這種轉(zhuǎn)錄特征定義了細(xì)胞在體內(nèi)平衡過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，并且對(duì)損傷具有高響應(yīng)性。

4 單細(xì)胞測(cè)序在肝纖維化研究中的應(yīng)用

肝纖維化的發(fā)生往往是由于長(zhǎng)期炎癥以及反復(fù)的肝損傷等導(dǎo)致纖維發(fā)生和纖維溶解之間的不平衡，形成纖維結(jié)節(jié)，從而破壞了肝臟結(jié)構(gòu)、再生潛能和肝功能，長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)纖維化最終可能會(huì)向肝硬化、腫瘤等癥狀進(jìn)一步惡化。因此，在單細(xì)胞分辨率水平解析肝纖維化狀態(tài)下的肝臟組織，會(huì)為我們理解、治療和預(yù)防肝纖維化提供強(qiáng)大的理論基礎(chǔ)。Dobie等[31]使用單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)】岛屠w維化小鼠肝臟中的肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，揭示了跨肝小葉的星狀細(xì)胞（HSC）的空間分區(qū)，表明阻斷LPAR1后會(huì)抑制脂肪肝動(dòng)物模型中的肝纖維化，從而確定了LPAR1為抑制膠原蛋白產(chǎn)生的治療靶標(biāo)，同時(shí)高精度地解析了驅(qū)動(dòng)肝纖維化的關(guān)鍵膠原生成細(xì)胞。同時(shí)，Krenkel等[32]將肝纖維化小鼠體內(nèi)靜息的星狀細(xì)胞和活化的成纖維細(xì)胞，與體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序進(jìn)行比較，表征了纖維化狀態(tài)下星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的高度異質(zhì)性，鑒定了肝纖維化中星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞亞型的存在。這些研究讓我們從單細(xì)胞角度對(duì)肝纖維化狀態(tài)下肝臟環(huán)境有了新的認(rèn)識(shí)，這可能為未來(lái)預(yù)防和治療肝纖維化、肝硬化等疾病提供機(jī)會(huì)。

5 單細(xì)胞測(cè)序在肝臟腫瘤研究中的應(yīng)用

在全球范圍內(nèi)，肝癌是最常見的致命惡性腫瘤[33]，其高異質(zhì)性、耐藥性、增殖轉(zhuǎn)移迅速、免疫微環(huán)境復(fù)雜等特征一直是造成疾病難以治愈的重要原因。為了了解腫瘤異質(zhì)性與腫瘤相關(guān)的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)特征間的關(guān)系，Duan等[34]使用單細(xì)胞全基因組測(cè)序分析了乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染相關(guān)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的男性腫瘤細(xì)胞和正常肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)特定的HCC可能是單克隆或多克隆來(lái)源，起始克隆的早期肝內(nèi)擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致同步多灶性腫瘤的形成。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了肝細(xì)胞癌中多種不同的腫瘤進(jìn)化機(jī)制，針對(duì)不同的腫瘤模型，需要特定的治療策略。針對(duì)肝細(xì)胞癌免疫微環(huán)境復(fù)雜這一現(xiàn)象，Zhang等[35]結(jié)合2種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從5個(gè)免疫相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)了肝細(xì)胞癌的CD45+免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息，揭示了各種CD45+免疫細(xì)胞類型的動(dòng)態(tài)特性，為我們對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)雜免疫環(huán)境的認(rèn)識(shí)增加了新的維度。為了解析癌組織肝轉(zhuǎn)移性的機(jī)制，Zhang等[36]對(duì)從大腸癌患者體內(nèi)檢測(cè)出的肝轉(zhuǎn)移癌組織和鄰近組織的樣品進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序研究，分析了癌細(xì)胞和T細(xì)胞群體的動(dòng)態(tài)變化途徑以及相關(guān)基因的表達(dá)與患者存活率的相關(guān)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路被激活并促進(jìn)了粒細(xì)胞遷移。這為闡明腫瘤的微環(huán)境組成，以及大腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制鋪平了道路。

近年來(lái)，逐漸興起的腫瘤免疫療法進(jìn)入大眾視線，其關(guān)鍵在于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在腫瘤中的分布以及預(yù)測(cè)其在癌癥中可能造成的臨床反應(yīng)。因此，Zheng等[37]對(duì)6名肝細(xì)胞癌患者的外周血、腫瘤和鄰近正常組織中的T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在肝臟腫瘤組織中，特定的T細(xì)胞亞群（如CD8+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）被優(yōu)先富集并且克隆擴(kuò)增，另外鑒定出LAYN基因在活化的CD8+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并抑制CD8+T細(xì)胞的功能。這組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為了解癌癥的免疫狀況提供了寶貴的見解和豐富的資源。在肝癌相關(guān)研究中，有大量報(bào)道表明，較高數(shù)量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatingtumor cells，CTC）與不良的臨床結(jié)果之間存在直接的相關(guān)性[38]，但對(duì)于CTC完整分子特征的研究卻很少。因此，D'Avola等[39]使用高密度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)表征肝癌患者中的CTC，證明了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，這有助于檢測(cè)HCC中已知的致癌驅(qū)動(dòng)程序，并為使用液體活檢開發(fā)肝癌生物標(biāo)志物提供了全新的工具。針對(duì)腫瘤內(nèi)高度異質(zhì)性這一現(xiàn)狀，Ho等[40]使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析腫瘤內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性以檢測(cè)具有重要意義的稀有細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)根據(jù)EPCAM基因的表達(dá)高低可分出2個(gè)不同的主要細(xì)胞群，即CD24+和CD44+的細(xì)胞，表明肝細(xì)胞癌組織中可能存在與腫瘤增殖相關(guān)的新型細(xì)胞亞群。

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷改善，單細(xì)胞基因組、DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法都日漸成熟，但是，要同時(shí)準(zhǔn)確分析單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異，DNA甲基化組、轉(zhuǎn)錄組及其之間相互調(diào)節(jié)的機(jī)制，這些組學(xué)方法需要在同一細(xì)胞中進(jìn)行。因此，Hou等[41]使用單細(xì)胞三重基因組測(cè)序技術(shù)（single-cell triple omics sequencing，scTrio-seq）研究人類肝細(xì)胞癌組織樣品中的癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)亞群，其DNA拷貝數(shù)、DNA甲基化和RNA表達(dá)水平均不同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大規(guī)模的基因組拷貝數(shù)變異會(huì)導(dǎo)致獲得或丟失的基因組區(qū)域內(nèi)基因的RNA表達(dá)成比例變化，而這些基因組拷貝數(shù)變異通常不會(huì)影響這些區(qū)域的DNA甲基化。這為剖析基因組和表觀基因組異質(zhì)性對(duì)細(xì)胞群中轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的影響提供了新方向。

6 結(jié)語(yǔ)

在過(guò)去的幾年里，單細(xì)胞捕獲技術(shù)取得了顯著進(jìn)步，諸如微移液、梯度稀釋、顯微操作、流動(dòng)輔助細(xì)胞分選等新方法在不斷引入和改善，其中微流控平臺(tái)被廣泛應(yīng)用于分離單個(gè)細(xì)胞，取得了巨大的成功[42]，但在組織解離過(guò)程中對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息的影響還不得而知。另外，避免酶蛋白水解并最小化解離過(guò)程導(dǎo)致的基因表達(dá)變化，可能對(duì)我們分析細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，特別是解離敏感細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，具有明顯的幫助。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已成為一種在細(xì)胞水平上解構(gòu)復(fù)雜組織的強(qiáng)大工具。在這項(xiàng)技術(shù)出現(xiàn)之前，幾乎沒有對(duì)肝臟組織以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行的研究，這極大地限制了對(duì)肝臟正常生理功能和疾病狀態(tài)的分子水平的理解。目前可用的各種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)中，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是最成熟，也是應(yīng)用最頻繁和最廣泛的方法。它利用更先進(jìn)的技術(shù)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組信息，其研究方向包括惡性腫瘤、免疫反應(yīng)和基質(zhì)細(xì)胞亞群，以及促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞間相互作用等。

應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)正常和疾病狀態(tài)下肝臟結(jié)構(gòu)的單細(xì)胞水平解析以及肝臟相關(guān)疾病的發(fā)展惡化機(jī)制研究也在不斷層層深入，如在鑒定新細(xì)胞亞群、解析細(xì)胞間高度異質(zhì)性、探索細(xì)胞發(fā)育軌跡、發(fā)現(xiàn)全新炎癥和腫瘤標(biāo)志物、認(rèn)識(shí)腫瘤免疫微環(huán)境、定位疾病發(fā)展惡化的關(guān)鍵細(xì)胞類型等方面，都有了許多新的發(fā)現(xiàn)。但同時(shí)，有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題制約了這項(xiàng)技術(shù)在肝臟研究中的應(yīng)用。首先，就是難以獲取新鮮肝臟組織；其次，肝臟組織中的一些易受剪切力、離心力等刺激的細(xì)胞類型（如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等）在單細(xì)胞懸液制備過(guò)程中極易發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，這對(duì)最終細(xì)胞基因表達(dá)是否有影響還不得而知；另外，還可能致使有些細(xì)胞類型全部死亡，這會(huì)掩蓋對(duì)這一細(xì)胞類型的探索，一定程度上破壞了組織結(jié)構(gòu)解析的完整性。

單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域正在迅速發(fā)展，基礎(chǔ)化學(xué)和平臺(tái)技術(shù)不斷取得的新進(jìn)展使人們能夠以前所未有的分辨率研究單個(gè)細(xì)胞。未來(lái)這一技術(shù)無(wú)疑將在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，并將為了解組織發(fā)育、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、治療耐藥性的發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移和演變的遺傳驅(qū)動(dòng)因素提供機(jī)會(huì)。隨著新技術(shù)允許每個(gè)實(shí)驗(yàn)捕獲更多數(shù)量的細(xì)胞，以及多種實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)合，一次提取出的細(xì)胞信息也會(huì)越來(lái)越多，這種趨勢(shì)可能會(huì)持續(xù)下去?？梢灶A(yù)見的是，大規(guī)模、高通量將是下一步單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展方向。與此同時(shí)，其成本的下降和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，會(huì)使該技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用，甚至有可能在將來(lái)的某一天徹底改變我們對(duì)疾病研究的方式。