不同癌癥核酸適配體篩選的研究進(jìn)展

李名一，姜良勇，高 川，劉媛媛

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154004；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

癌癥是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，對(duì)人類健康和生命構(gòu)成極大威脅。近年來，隨著人口老齡化，發(fā)病率和死亡率將整體繼續(xù)呈上升趨勢(shì)，我國(guó)癌癥防治面臨嚴(yán)峻的形勢(shì)[1]。然而癌癥早期的體征和癥狀特異性不明顯，各種腫瘤標(biāo)志物也較少，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷，同時(shí)癌癥的治療，比如手術(shù)切除不徹底、復(fù)發(fā)率高和轉(zhuǎn)移率高等是影響癌癥治療效果的主要問題。因此，從分子水平上發(fā)展分子靶向藥物及免疫治療藥物，可以大大提高癌癥病人的治療效果。核酸適配體橫空出世，它俗稱“核酸抗體”[2]，區(qū)別于相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗體。這個(gè)術(shù)語是由于抗體和適配子之間的相似性而產(chǎn)生的，它可以是單鏈 DNA，也可以是RNA，由于其良好的選擇性，還有對(duì)靶標(biāo)的高親和力，適配子作為分子探針在確保食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷和治療等方面具有相當(dāng)大的潛力。它具有與單克隆抗體相匹敵的蛋白質(zhì)靶標(biāo)的親和力和特異性。此外，適配子與抗體相比有一定的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兛梢曰瘜W(xué)合成，并且可以引入修飾來提高它們的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)特性。一些針對(duì)治療重要靶點(diǎn)的適配子已經(jīng)在細(xì)胞和動(dòng)物模型中顯示出有效性，少數(shù)適配子現(xiàn)在正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)或正被用作藥物。因此適配子作為一類用于疾病診斷和治療的新型分子探針引起了人們的極大關(guān)注，因此我們研究各種癌癥的核酸適配體來用于疾病的治療。

1 與乳腺癌相關(guān)的核酸適配體

乳腺癌是女性最常見的癌癥，它是女性中最常見的癌癥，它是當(dāng)今女性癌癥死亡的第二大原因，僅次于肺癌。乳腺癌的有效和成功治療的關(guān)鍵是及時(shí)的診斷。鑒于癌癥的復(fù)雜性和多樣性，為了提高靈敏度和選擇性，有學(xué)者利用酵母和哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)從隨機(jī)組合表達(dá)文庫(kù)中分離得到了一個(gè)新的肽適配子Id1/3-PA7，它能與Id1和Id3特異地相互作用。從而抑制Id1和Id3對(duì)E47蛋白的截留，激活E-box啟動(dòng)子，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN1A和CDKN1B)的表達(dá)，所以說肽適配子Id1/3-PA7能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞周期阻滯和凋亡。它可能是一種無毒的外源性藥物，可顯著刺激乳腺癌細(xì)胞的抗增殖和凋亡效應(yīng)，這與Id1和ID3的表達(dá)失控有關(guān)。ID蛋白的過度表達(dá)，常見于包括乳腺癌在內(nèi)的幾種人類惡性腫瘤中。它的過度表達(dá)及其在腫瘤發(fā)生、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和新血管生成中的作用使其成為抗癌治療的有吸引力的靶點(diǎn)，此研究將可能是治療乳腺癌和其他癌癥的一種新策略。

雌激素受體(ER)約在 70%的乳腺癌患者中會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。這是因?yàn)?ER 的高表達(dá)增加細(xì)胞分裂引起突變，破壞細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。雌激素反應(yīng)元件(ERE)，它是雌二醇靶基因啟動(dòng)子中的一段 DNA短序列，與雌激素-ER 復(fù)合物有高親和力。何煦，陳杰等人采用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技(SELEX)從 ERE 寡核苷酸池中篩選出一段與乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7(表達(dá)ER)作為 ER 核酸適配體[3]，通過體外實(shí)驗(yàn)證明，它能夠抑制體外乳腺癌細(xì)胞的增殖。目前治療乳腺癌輔助藥物有很多，但是有很多結(jié)果顯示這些藥物長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致耐藥。通過核酸適配體抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而成為乳腺癌患者的一種治療手段。 而且它對(duì)人正常乳腺上皮細(xì)胞沒有任何毒副作用。

2 與肺癌相關(guān)的核酸適配體

肺癌是位于惡性腫瘤死亡之榜首，對(duì)人類的身體健康產(chǎn)生了很多的威脅。肺癌包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，肺癌是中國(guó)近年來癌癥死亡的首要原因[4]。大約有80%的肺癌患者被診斷為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中化療仍然是非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段。

肺癌干細(xì)胞(CSCs)影響非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后，所以消除肺CSCs可以提高藥物對(duì)肺癌的治療效果，CD133抗原是實(shí)體腫瘤(包括肺癌)中可能的CSCs標(biāo)記物，Jun 等人制備一種新型的CD133適配子修飾的DTX脂質(zhì)體系統(tǒng)，并對(duì)其體內(nèi)外特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CD133-DTX LP的DTX釋放相對(duì)較慢，這是因?yàn)镃D133適配子的存在可能會(huì)阻礙藥物的釋放。在此研究中，研究表明CD133適配子修飾DTX LP可顯著抑制細(xì)胞增殖，提高治療效果，體內(nèi)顯像結(jié)果也表明CD133-DTX LP具有很好的腫瘤靶向性。此研究中研究者可以發(fā)現(xiàn)核酸適配體在肺癌治療中起著很重要的作用。

半乳糖凝集素-1(Gal-1)是一種β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。它能夠參與腫瘤免疫逃逸，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Yao-T等人證明一種新型的Gal-1靶向DNA適配子AP-74M-545，其與Gal-1高親和力結(jié)合。通過實(shí)驗(yàn)表明，Gal-1適配子通過阻斷Gal-1和CD45之間的相互作用而抑制腫瘤生長(zhǎng)，從而從凋亡中拯救T細(xì)胞，恢復(fù)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。這些結(jié)果表明AP-74M-545可能是一種潛在的腫瘤免疫治療策略。因此研究出具有高特異性適配體是腫瘤治療的關(guān)鍵。

3 與肝癌相關(guān)的核酸適配體

肝癌是目前世界上第三大致命癌癥，世界上半數(shù)以上肝細(xì)胞癌發(fā)生在我國(guó)，中青年居多。肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病快，然而沒有比較有效的治療方法。最主要問題是，大多數(shù)癌癥都是在晚期診斷出來的，手術(shù)切除已經(jīng)不可行了。 肝癌篩查方法主要依賴于測(cè)量血清R-胎兒蛋白(AFP)的水平，這是一種生物標(biāo)志物，以及超聲成像。AFP的敏感度和特異度非常有限。此外，在癌癥發(fā)展的早期階段，即治療最有效的階段，甲胎蛋白并不總是升高，有30%左右肝癌患者的 AFP水平并不升高，最新肝癌診治指南已經(jīng)不再?gòu)?qiáng)調(diào)聯(lián)合 AFP 檢測(cè)的重要性，而且影像學(xué)只能提供有限的形態(tài)學(xué)信息。因此要達(dá)到早期診斷的目的，必須有分子探針能夠識(shí)別的癌癥特異性生物標(biāo)志物[5]。

Di等人應(yīng)用了一種新開發(fā)的細(xì)胞-SELEX(指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化)方法來產(chǎn)生特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞的分子探針，在識(shí)別適配子的過程中，使用了兩個(gè)肝癌細(xì)胞系：肝癌細(xì)胞系BNL 1ME A.7R.1(Mear)和非腫瘤細(xì)胞系BNL C1.2(BNL)。兩種細(xì)胞系均來源于Balb/CJ小鼠。BNL細(xì)胞系是來自同一只小鼠的成對(duì)細(xì)胞系，這兩個(gè)細(xì)胞系有不同的生物學(xué)表型，一個(gè)是癌細(xì)胞系，另一個(gè)不是，其中BNL作為對(duì)照組。鑒定出來一組適體，識(shí)別出特定的癌細(xì)胞特異性適配子，那就是TLS9a和TLS11a，它們能夠特異性地識(shí)別Kd在納摩爾范圍內(nèi)的癌細(xì)胞系Mear，最終還評(píng)估了這兩種適配子治療人肝癌的可能性。事實(shí)上通過選定的適體可以去探索疾病的分子本質(zhì)，從而獲得更多的信息，也為疾病的治療也提供了幫助。

丙型肝炎病毒感染是一個(gè)世界性的健康問題，可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌。病毒NS3絲氨酸蛋白酶除了在病毒多蛋白加工中發(fā)揮作用外，還參與與多種細(xì)胞之間的相互作用，還會(huì)導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。目前NS3被認(rèn)為是抗病毒藥物的主要靶點(diǎn)。為了抑制NS3蛋白酶活性作為抑制HCV復(fù)制的手段，Meital等人采用了一種新的細(xì)菌遺傳篩選方法來分離NS3抑制肽適配子進(jìn)行研究，結(jié)論顯示肽適配子在體外對(duì)NS3蛋白酶活性有抑制作用，IC50在低微摩爾范圍內(nèi)，它有望成為干擾HCV生命周期和致病性的一種很有前途的抗病毒方法。

4 與前列腺癌相關(guān)的核酸適配體

前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的一種上皮性惡性腫瘤。前列腺癌的診斷主要依靠直腸指診、前列腺腫瘤細(xì)胞表面抗原PSA、經(jīng)直腸前列腺超聲和盆腔MRI檢查，PSMA被認(rèn)為是一種很好的前列腺腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物。血清PSA測(cè)定高于4.0 ng/mL的臨界值通常被認(rèn)為是陽性的，PSMA的表達(dá)主要是前列腺特異的，在大腦、唾液腺和小腸中的表達(dá)水平非常低。但是由于PSA靈敏度有限，因此為了做到更加準(zhǔn)確的診斷，我們探索并創(chuàng)建核酸酶穩(wěn)定的RNA適配子來結(jié)合和抑制前列腺腫瘤細(xì)胞表面抗原PSMA的酶活性。 Shawn E.等人研究鑒定出來兩個(gè)人工合成的寡核苷酸(適配子)，它們被分別命名為xPSM-A9和xPSM-A10[6]，它們是從最初的40mer文庫(kù)中挑選出來的，該文庫(kù)由61014個(gè)隨機(jī)序列RNA分子組成，目的是為了它們能夠與代表PSMA胞外706個(gè)氨基酸的重組蛋白(稱為xPSM)結(jié)合，這些適配子的高親和力通過它們抑制PSMANAALADase活性的能力來證明，相信在未來會(huì)有更多的PSMA適配子用來進(jìn)一步研究，來評(píng)估它們作為前列腺癌診斷和治療藥物的前景。

5 展望

核酸適配體的優(yōu)勢(shì)在于其廣闊的前景和諸多優(yōu)點(diǎn)，如適配體的特異性、選擇性，能夠識(shí)別目標(biāo)癌細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。其缺乏免疫原性，可降低免疫反應(yīng)。許多適配子(如IgE，IFN-g)亦可作為治療靶點(diǎn)[7]。而且它們足夠大，可以與生物聚合物靶標(biāo)緊密而特異地結(jié)合，與傳統(tǒng)藥物相比，似乎更難對(duì)它們產(chǎn)生抗藥性。但是仍然還有許多問題需要解決：①它用SELEX篩選耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，目前被篩選出來的核酸適配體仍然非常少，所以需要研究出更多種類的核酸適配體；②它與靶點(diǎn)的結(jié)合，限制了檢測(cè)的靈敏(1)通過體外SELEX方法選擇的核酸適配體可能無法在體內(nèi)穿過屏障，也無法有效識(shí)別體內(nèi)特定的腫瘤蛋白質(zhì)，會(huì)使治療效果不好。解決辦法就是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為靶標(biāo)，這樣得到的核酸適配體會(huì)具有更好的靶向特異性及穩(wěn)定性[8]。(2)核酸適配體的治療性化合物是針對(duì)一種單一的耐藥機(jī)制，難以完全克服腫瘤的多藥耐藥性腫瘤性。改進(jìn)方法是對(duì)給藥系統(tǒng)進(jìn)行不斷完善。(4)如一些限制核酸適配體技術(shù)，因?yàn)樗莫?dú)家專利也影響著核酸適配體的發(fā)展。目前核酸適配體還不及抗體應(yīng)用范圍廣，其仍在不斷的研究中，因此進(jìn)一步在各種腫瘤疾病中對(duì)核酸適配體進(jìn)行更廣泛的研究，需要業(yè)內(nèi)專家不斷的努力。相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多不同的核酸適配體將被篩選出來，這對(duì)疾病的早期診斷與治療具有重要意義。