斑馬魚糖尿病模型的構(gòu)建及應(yīng)用進(jìn)展

江 霞，錢豪杰，魏 迅，鄭羽旋，周正宇

（1. 蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，蘇州 215123；2. 蘇州市科學(xué)技術(shù)局，蘇州 215002）

糖尿病是以慢性高血糖為特征，由胰島素分泌或其作用缺陷引起的非傳染性代謝性疾病。國際糖尿病聯(lián)合會（International Diabetes Federation，IDF）指出，2015年全球有4.15億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2040年糖尿病患者將增至6.42億[1-2]。隨著中國老年人口數(shù)目增加，老齡化速度加快，最近三十多年來中國糖尿病發(fā)病率從0.67%飆升至10.9%，因此中國已經(jīng)成為糖尿病大國之一[3]。已知糖尿病主要分為1型、2型以及妊娠糖尿病，其中多數(shù)患者為1型糖尿病或2型糖尿病。

動物模型是研究人類疾病發(fā)病機(jī)制的良好材料，且便于治療藥物的研發(fā)與篩選。目前較成熟的糖尿病動物模型有大鼠、小鼠、兔和小型豬等，它們的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好，缺點(diǎn)是需要樣本量大、實(shí)驗(yàn)周期長（通常需要2～3個月），且難以完全呈現(xiàn)出人類糖尿病的臨床癥狀和發(fā)病過程。因此，開發(fā)新的動物模型對糖尿病發(fā)病機(jī)制等比較醫(yī)學(xué)研究具有重要價值。

模式生物斑馬魚（Danio rerio）具有體積小、產(chǎn)卵多、可活體觀察組織、監(jiān)測生物進(jìn)程和建模周期短等優(yōu)點(diǎn)，且目前已完成的斑馬魚基因測序結(jié)果顯示斑馬魚與人類基因同源性高達(dá)87%[4-5]。此外，斑馬魚的胰腺在形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)上與哺乳動物非常相似，其胰腺是由外分泌腺和內(nèi)分泌腺兩部分組成，前者分泌胰液，后者分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑制素和胰多肽[6]。因此，斑馬魚可以用于糖尿病研究。本文對斑馬魚糖尿病模型的構(gòu)建及相關(guān)應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 1型糖尿病斑馬魚模型

1型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus）被稱為胰島素依賴性糖尿病，它主要是胰島β細(xì)胞自身免疫性炎性反應(yīng)導(dǎo)致β細(xì)胞破壞和功能損害，從而使胰島素分泌缺乏[7-8]。針對斑馬魚，雖然缺乏其自身免疫導(dǎo)致的1型糖尿病模型，但已經(jīng)開發(fā)出靶向損傷β細(xì)胞的1型糖尿病模型。目前，有3種通過破壞β細(xì)胞建立1型糖尿病模型的方法：手術(shù)切除、藥物誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因法。

1.1 手術(shù)切除法

手術(shù)是最早的糖尿病復(fù)制方法。早在1689年，Johann Conrad Brunner將犬的胰腺切除后，記錄了犬多飲、多食和多尿即“三多”現(xiàn)象；200多年后陸續(xù)有學(xué)者將胰腺與糖尿病聯(lián)系起來，并證明手術(shù)切除胰腺可誘發(fā)糖尿病[9-10]。但是有研究者在進(jìn)行肝癌和胰腺癌研究時，嘗試在光學(xué)顯微鏡下對用綠色熒光蛋白特異性標(biāo)記胰島的轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行胰腺切除，由于斑馬魚的胰腺較小且彌散性分布在肝臟、膽囊和腸道周圍，為此很難將胰腺完全切除[11-12]。因此，通過手術(shù)切除法建立斑馬魚糖尿病模型對研究者的操作技術(shù)和設(shè)備要求較高，不常用于斑馬魚。

1.2 藥物誘導(dǎo)法

嚙齒動物糖尿病模型的構(gòu)建普遍用化學(xué)藥物誘導(dǎo)。常用的化學(xué)藥物有四氧嘧啶（alloxan）和鏈脲佐菌素（streptozotocin），它們均可使β細(xì)胞凋亡，造成胰島素分泌不足，血糖升高。文獻(xiàn)報道，四氧嘧啶處理受精斑馬魚胚胎后，胚胎中胰島變小，且近一半的斑馬魚胚胎死亡，說明四氧嘧啶具有一定毒性[13-14]。另外，Olsen等[15]通過腹腔注射劑量為350 mg/kg的鏈脲佐菌素構(gòu)建了1型糖尿病成年斑馬魚模型，為了使斑馬魚處于高血糖狀態(tài)，需多次腹腔注射鏈脲佐菌素。鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的斑馬魚糖尿病模型不僅空腹血糖升高，胰島素表達(dá)水平降低，且出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病腎病和尾鰭再生障礙等[15-16]。與四氧嘧啶相比，鏈脲佐菌素的組織毒性相對較?。欢难踵奏た芍赂文I功能損害，建模死亡率較高。總之，化學(xué)藥物誘導(dǎo)糖尿病模型的方法操作簡單，可行性較高。

1.3 轉(zhuǎn)基因法

有研究報道了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（HS4-sst2:CFP; ins:PhiYFP-m-dest1-2TA-nfsB）lmcoo9，簡稱ins:NTR[10]。ins:NTR斑馬魚的胰島β細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白和硝基還原酶，硝基還原酶可使甲硝唑（metronidazole）轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素，破壞胰島β細(xì)胞。該轉(zhuǎn)基因斑馬魚經(jīng)腹腔注射甲硝唑3 d后，99.7%的β細(xì)胞損傷，但α細(xì)胞不損傷，斑馬魚出現(xiàn)高血糖；甲硝唑注射5～7 d后，β細(xì)胞數(shù)量開始增加，兩周后血糖恢復(fù)正常，推測可能是由于斑馬魚再生能力強(qiáng)，胰島內(nèi)單細(xì)胞增殖和分化使得β細(xì)胞再生[10,17]。

2 2型糖尿病斑馬魚模型

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus）受多種環(huán)境因素的誘導(dǎo)，主要特點(diǎn)是胰島素抵抗和胰島素分泌相對缺乏[18]。胰島素抵抗被認(rèn)為是2型糖尿病的主要驅(qū)動因素，主要是胰島素對其靶器官敏感性下降，表現(xiàn)為肌肉、肝臟和脂肪等胰島素靶組織對葡萄糖利用出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致葡萄糖滯留在血液中。在發(fā)病早期，胰島素與其靶細(xì)胞親和力下降，需要β細(xì)胞分泌和釋放更多的胰島素，引發(fā)胰高血糖素血癥，如此形成糖代謝紊亂和β細(xì)胞功能不足的惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致β細(xì)胞功能嚴(yán)重缺陷，引發(fā)2型糖尿病[18-20]。2型糖尿病的動物模型有自發(fā)性動物模型（如ob/ob小鼠）、誘發(fā)性動物模型（如高脂飲食與藥物干預(yù)共同誘導(dǎo)）和轉(zhuǎn)基因模型等[21]。斑馬魚2型糖尿病模型的構(gòu)建方法主要有3種：葡萄糖浸泡法、飲食誘導(dǎo)法和基因敲除法。

2.1 葡萄糖浸泡法

成年斑馬魚能夠調(diào)節(jié)其體內(nèi)水分和總?cè)苜|(zhì)濃度，且4～11月齡成年斑馬魚經(jīng)葡萄糖刺激的效果優(yōu)于1～3年成年斑馬魚。斑馬魚一般飼養(yǎng)在水溫為（28±2）℃、明暗周期為14 h/10 h的水循環(huán)系統(tǒng)中，正常喂食商用飼料或孵化好的豐年蝦。葡萄糖浸泡法有兩種方案：用2%的葡萄糖溶液連續(xù)浸泡14 d；隔天浸泡2%葡萄糖溶液，培養(yǎng)28～30 d。葡萄糖浸泡3～7 d后，斑馬魚體內(nèi)血糖水平明顯上升[22]。兩種方案進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，前者的優(yōu)點(diǎn)在于造模所需時間短，血糖相對穩(wěn)定，而缺點(diǎn)是會有20%的斑馬魚死亡。葡萄糖浸泡法可導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥如視網(wǎng)膜病變，因此可用于糖尿病視網(wǎng)膜病變研究[22-23]。另外，模式生物斑馬魚具有產(chǎn)卵多、胚胎透明的優(yōu)點(diǎn)，將受精5 d后的斑馬魚幼魚給予3%葡萄糖浸泡聯(lián)合高脂飲食，10 d即可得到2型糖尿病模型，非常適用于糖尿病藥物的研發(fā)與篩選。

2.2 飲食誘導(dǎo)法

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，肥胖容易引起高胰島素血癥和胰島素抵抗，也是發(fā)生2型糖尿病的重要危險因素。在嚙齒動物模型中，高脂肪飲食同時導(dǎo)致肥胖和2型糖尿病[24]。張靖溥課題組通過對成年斑馬魚過度喂食，結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)，獲得2型糖尿病斑馬魚模型[25]：模型組10周內(nèi)每天每只喂食60 mg豐年蝦和1%新鮮蛋黃液，10周后檢測發(fā)現(xiàn)該模型的血糖、脂質(zhì)表達(dá)和體質(zhì)指數(shù)均升高，肝臟、肌肉和大腦出現(xiàn)胰島素基因高表達(dá)，且肝臟中胰島素受體底物2與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的基因表達(dá)降低，這些表現(xiàn)與Oka等[26]研究的肥胖斑馬魚模型相似。

另外，日本西村研究團(tuán)隊(duì)通過過度喂食得到飲食誘導(dǎo)肥胖（diet-induced obesity，DIO）的斑馬魚，對DIO斑馬魚胰島素進(jìn)行增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記，得到Ins-EGFP DIO斑馬魚[27]；對該斑馬魚進(jìn)行8周的過度喂食，即利用自動喂食器每天每只喂食120 mg，連續(xù)8周每周稱體質(zhì)量，并測空腹血糖；過度喂食結(jié)束后，對斑馬魚模型進(jìn)行糖耐量和胰島素含量（通過綠色熒光蛋白間接反映）檢測，發(fā)現(xiàn)糖代謝異常。這與高日麗等[28]建立的自發(fā)緩解的2型糖尿病小鼠動物模型中糖代謝異常相類似。

2.3 基因敲除法

胰島素抵抗主要是胰島素與其作用的靶器官敏感性下降，因此敲低靶器官中胰島素受體（insulin receptor，INSR）基因表達(dá)可導(dǎo)致血糖升高。Maddison等[29]建立了肌肉INSR基因敲降的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其中骨骼肌抵抗（skeletal muscle insulin-resistant，zMIR）轉(zhuǎn)基因斑馬魚的骨骼肌中胰島素樣生長因子Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）受體失活，剛開始表現(xiàn)為β細(xì)胞數(shù)目代償性增加和正常的葡萄糖耐受性，但隨著斑馬魚年齡的增加，β細(xì)胞數(shù)目減少，出現(xiàn)葡萄糖耐受性差，空腹血糖升高。另外，有研究利用成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9（Cas9）]技術(shù)敲降斑馬魚肝臟中INSR活性，可導(dǎo)致空腹低血糖和餐后高血糖[30]。

斑馬魚INSR有A和B兩種，Gong等[31]和Yang等[32]課題組分別對這兩種斑馬魚INSR基因進(jìn)行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除后的斑馬魚出現(xiàn)了高血糖現(xiàn)象和β細(xì)胞代償性增加，其中INSRA－/－斑馬魚餐后血糖升高程度遠(yuǎn)高于INSRB－/－斑馬魚，而且發(fā)現(xiàn)INSRA－/－斑馬魚在抑制糖異生和刺激糖酵解時出現(xiàn)障礙，而INSRB－/－斑馬魚在刺激糖酵解方面也存在嚴(yán)重缺陷，提示INSRA和INSRB在維持斑馬魚穩(wěn)態(tài)方面具有重疊和多樣化的功能。然而在肌肉組織中INSRA表達(dá)低的MKR轉(zhuǎn)基因2型糖尿病小鼠出現(xiàn)高血糖癥狀，但未觀測到β細(xì)胞團(tuán)代償性增加的現(xiàn)象，這可能是由于INSRA－/－和INSRB－/－斑馬魚的糖原儲存受損和糖異生抑制減弱引起的。

3 斑馬魚糖尿病模型的應(yīng)用進(jìn)展

斑馬魚是理想的脊椎模式生物。它的胰腺以及胰島素作用敏感的靶組織如肝臟、肌肉等在進(jìn)化上均具有保守性，而且糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵機(jī)制與一些哺乳動物非常相似。碳水化合物是維持生命活動所需的主要物質(zhì)。據(jù)魚類在碳水化合物利用方面的研究表明，斑馬魚糖代謝速度高于肉食性魚類，其生長速度與碳水化合物含量成正比。另外，糖代謝相關(guān)的重要基因如己糖激酶等在斑馬魚體內(nèi)表達(dá)活躍，而這些基因缺失會導(dǎo)致斑馬魚胚胎神經(jīng)缺陷[33]。因此，斑馬魚非常適用于糖代謝方面的研究，可用于糖尿病發(fā)病機(jī)制研究及其藥物的研發(fā)與篩選。

3.1 糖尿病并發(fā)癥研究

糖尿病是受多種病因引起的代謝紊亂性疾病，長期高血糖將引起大血管或微血管并發(fā)癥，如冠狀動脈疾病、視網(wǎng)膜病變、慢性腎病和中樞神經(jīng)病變等，這也是該病致殘和致死的重要原因[34-35]。相比于其他動物模型，斑馬魚實(shí)驗(yàn)周期短，按照不同的斑馬魚造模方法可呈現(xiàn)不同的并發(fā)癥，適用于糖尿病研究。

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是威脅糖尿病患者視力的慢性炎性疾病，是由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的大量丟失或損壞所導(dǎo)致[36]。斑馬魚與哺乳類動物有非常相似的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎置于130 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液中溫育3 d，可快速得到DR模型，該模型出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張與缺失、血管上皮生長因子和一氧化氮濃度升高[37]。另外，在含有4%葡萄糖的培養(yǎng)液中孵育28 d后，雄性斑馬魚顯示視網(wǎng)膜增厚，視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)硬化[38]。而鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立的糖尿病模型會出現(xiàn)視網(wǎng)膜退化變薄，這一現(xiàn)象在人類及其他哺乳類動物中也會發(fā)生[15]。

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是常見的糖尿病并發(fā)癥，患者出現(xiàn)腎小管基底膜增厚、腎小球膜增厚或細(xì)胞外基質(zhì)積累等情況[39]。胰腺十二指腸同源盒1（pancreatic duodenal homeobox factor 1，Pdx 1）基因在斑馬魚胰腺的形成與分化中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用嗎啉代對Pdx 1基因敲降建立的斑馬魚胚胎出現(xiàn)高血糖，且導(dǎo)致前腎小球增大、前腎濾過屏障受損和足細(xì)胞發(fā)育缺陷[40]。而且在成年斑馬魚中，腹膜內(nèi)注射鏈脲佐菌素引起的高血糖會導(dǎo)致腎小球基底膜增厚，這在人類中也可以看到[15]。

糖尿病潛在的并發(fā)癥通常涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，它是由中風(fēng)和其他血管疾病引發(fā)突觸傳遞或神經(jīng)可塑受損，從而影響大腦進(jìn)程，易引起抑郁癥、焦慮癥和阿爾茨海默癥[41]。斑馬魚具有與人類基因高度同源、易于實(shí)驗(yàn)操作、體外受精、早期發(fā)育的特點(diǎn)，且與人類糖尿病相關(guān)基因高度同源，非常適合神經(jīng)科學(xué)研究。已知神經(jīng)炎性反應(yīng)與新陳代謝不足是導(dǎo)致人類感情障礙（如焦慮或抑郁）的病因，因此斑馬魚作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中的新型生物，可用于糖尿病與感情相關(guān)的重疊發(fā)病機(jī)制研究[42]。研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素藥物誘導(dǎo)斑馬魚可影響斑馬魚的早期神經(jīng)發(fā)育，減少神經(jīng)產(chǎn)生（包括神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化和存活），使腦容量不足，合并引起斑馬魚的血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）缺陷，且腦損傷的干細(xì)胞增殖能力下降，兩周后該模型出現(xiàn)神經(jīng)紊亂，從而損害關(guān)鍵神經(jīng)源性區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞增殖[41]。此外，糖尿病相關(guān)的其他神經(jīng)系統(tǒng)病變，如聽力損失同樣可用斑馬魚建模?？傊?，糖尿病及其相關(guān)的高血糖引起的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷很容易在斑馬魚身上建模。

3.2 糖尿病患者腸道菌群研究

腸道微生物菌群在疾病風(fēng)險與其進(jìn)展中發(fā)揮潛在作用，因此了解糖尿病發(fā)生過程中腸道菌群的變化具有重要意義。糖尿病患者腸道菌群研究發(fā)現(xiàn)，腸道中革蘭陰性菌增加，脂多糖釋放[43]。脂多糖參與抗炎巨噬細(xì)胞M2向促炎巨噬細(xì)胞M1轉(zhuǎn)化，促使促炎因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）釋放[43-44]。對糖尿病斑馬魚的腸道菌群研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病斑馬魚的β蛋白細(xì)菌和黃桿菌-Ⅱα多樣性較低，而較低的菌群多樣性與胰島素抵抗相關(guān)，菌群可能使精氨酸和脯氨酸代謝下調(diào)，導(dǎo)致谷氨酸也下調(diào)，而精氨酸及其代謝物可促進(jìn)胰島素分泌，并改善胰島素抵抗[45]。因此，糖尿病斑馬魚模型的菌群組成與人類2型糖尿病患者的相似，可作為研究肥胖及其相關(guān)疾病中宿主-細(xì)菌相互作用的模式生物。

3.3 糖尿病藥物篩選

斑馬魚胚胎是透明的，且其繁殖頻繁、數(shù)量龐大，擁有完整的基因組測序，并且可以有效地進(jìn)行基因突變，因此非常適合進(jìn)行大規(guī)模的糖尿病藥物或基因篩選。Emfinger等[46]構(gòu)建了ATP-敏感性鉀通道（ATP-sensitive K+channels，KATP）功能獲得型（gain-of-function，GOF）轉(zhuǎn)基因斑馬魚，該類型斑馬魚阻斷了葡萄糖依賴的Ca2+升高，導(dǎo)致嚴(yán)重的高血糖，這與哺乳類動物高血糖的后果相似，因此這種模型可能有助于糖尿病藥物及基因修飾的篩選。

4 總結(jié)與展望

建立良好的糖尿病動物模型有利于臨床藥物的研發(fā)與篩選。斑馬魚的遺傳背景明確，因此其作為研究糖尿病發(fā)病機(jī)制的新興糖尿病模型，相關(guān)研究結(jié)果可能為人類糖尿病治療提供新的理論依據(jù)。另外，斑馬魚糖尿病模型可以彌補(bǔ)其他糖尿病動物模型的不足。因此，斑馬魚用于糖尿病機(jī)制研究，可為糖尿病臨床治療提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。