適用于轉(zhuǎn)錄組測序的大蒜花器官總RNA的提取方法

陳雅楠，尚云濤，范寶莉，劉曉穎，曹寶鑫，王振英

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.天津師范大學(xué) 天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387）

大蒜（Allium sativum L.）是重要的經(jīng)濟作物之一，在蔥屬作物中居第二位[1]，除作為調(diào)味品外，還具有很高的醫(yī)用價值和保健價值[2].由于大蒜具有不育性，因此通常以鱗莖為材料進行無性繁殖，導(dǎo)致大蒜的遺傳多樣性單一且種質(zhì)資源急劇退化，這成為大蒜常規(guī)雜交育種以及開展遺傳學(xué)研究的瓶頸[3-6].

植物總RNA 的提取是進行下游分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，高質(zhì)量的RNA 是下游實驗成功的保障[7]，是進行RT-PCR、轉(zhuǎn)錄組測序等下游分子生物學(xué)操作的基礎(chǔ).轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）具有低成本、高通量、短周期的優(yōu)勢，通過轉(zhuǎn)錄組測序和分析可以得到特定條件下某些基因表達的信息，據(jù)此推斷相應(yīng)未知基因的功能，揭示特定調(diào)節(jié)基因的作用機制.轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對RNA 的質(zhì)量和產(chǎn)率均有很高的要求[8].大蒜各組織中含有豐富的多糖多酚類物質(zhì)，成分較復(fù)雜.多糖的理化性質(zhì)與RNA 極為相似，會在提取RNA 的過程中與其發(fā)生共沉淀從而嚴重影響RNA 的質(zhì)量[9]；多酚類物質(zhì)被氧化后會與RNA 不可逆結(jié)合，導(dǎo)致RNA失去活性，也可能與RNA 結(jié)合后形成不溶性復(fù)合物，在抽提操作中致使RNA 丟失[10].因此，用常規(guī)提取方法很難分離到質(zhì)量好、產(chǎn)率高的大蒜RNA.大蒜花器官同鱗莖等營養(yǎng)器官相比，生長受環(huán)境因素影響較大，再加上植物材料品質(zhì)的不確定性和取材難度大，使得從大蒜花器官中提取RNA 更具挑戰(zhàn)性.因此，獲得質(zhì)量好、產(chǎn)率高的RNA 提取方法對于大蒜花器官的分子生物學(xué)研究非常重要.

近年來，研究者們對富含多糖多酚類的植物如蘋果[11]、椰子[12]、芒果[13]、新疆野蘋果[14]、越桔[15]、紅景天[16]等的RNA 提取方法不斷進行改良，分別建立了獲得高質(zhì)量RNA 的提取方法，并將其用于轉(zhuǎn)錄組測序分析[8，17-18].關(guān)于大蒜RNA 提取方法改良的研究也有少量報道，如張愛民等[19]用3 種方法分別提取貴陽紫皮大蒜的幼嫩葉片、蒜薹和鱗莖的RNA，結(jié)果表明，從葉片中提取的總RNA 質(zhì)量較好，產(chǎn)率較高，從蒜薹和鱗莖中提取的總RNA 的純度不高.從大蒜花器官中提取RNA 的方法則未有專門報道.本研究先以大蒜中多糖多酚含量高的鱗莖為實驗材料，分別利用2 種試劑盒方法、CTAB 法、Trizol 法以及改進酸性異硫氰酸胍法提取總RNA，對RNA 的質(zhì)量、濃度和純度進行比較分析，篩選出效果好的方法用于大蒜花器官RNA 的提取，為后續(xù)的大蒜花器官發(fā)育相關(guān)基因的研究奠定實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

寶坻大蒜“六瓣紅”，取自天津師范大學(xué)生物科技園.

2018 年4—6 月份，采集大蒜花發(fā)育不同階段的樣品.從花芽開始分化至花衰老，將大蒜花器官發(fā)育分為6 個時期：大蒜抽薹前的花器官稱為花芽（bud），根據(jù)花芽長度不同分為3 個時期，分別記作B1、B2、B3；大蒜抽薹后的花器官稱為花蕾（flower），花蕾以花粉母細胞減數(shù)分裂階段界定3 個時期，分別記作F1、F2、F3.每次取材時間為上午 9：00～12：00，以天氣晴朗為佳.取材后將花器官組織迅速轉(zhuǎn)移至液氮中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

鱗莖取鮮材，現(xiàn)取現(xiàn)用.每次取樣均為5 次生物學(xué)重復(fù)，每個樣品均為3 次技術(shù)重復(fù).

1.2 主要試劑

1.2.1 試劑盒

植物總RNA 提取試劑盒分別購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司、天根生化科技（北京）有限公司.

1.2.2 CTAB 法主要試劑

①CTAB 提取液：質(zhì)量分數(shù)為2%的CTAB，質(zhì)量分數(shù)為 2%的 PVP，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-Cl（pH 值為 8.0），2.0 mol/L NaCl，滅菌后加入體積分數(shù)為2%的β-巰基乙醇；②氯仿-異戊醇（體積比為24∶1）；③8 mol/L LiCl；④質(zhì)量分數(shù)為0.5%的SDS.

1.2.3 Trizol 法主要試劑

①Trizol 試劑（適用于多糖多酚）購自寶生物工程（大連）有限公司；②5 mol/L NaCl；③高鹽溶液：0.8 mol/L 檸檬酸鈉與1.2 mol/L NaCl 混合.

1.2.4 改進酸性異硫氰酸胍法主要試劑

①去RNA 酶處理水：1 mL DEPC 原液溶于1 L超純水中，至終質(zhì)量濃度為 1 μg/mL；②Solution D 提取液：23.63 g 異硫氰酸胍溶于20 mL 滅活的去RNA 酶處理水中，65 ℃水浴助溶，溶解完全后加入1.8 mL pH值為7.0 的0.75 mol/L 檸檬酸鈉，混勻后加入0.25 g 十二烷基肌氨酸鈉和質(zhì)量分數(shù)為2%的PVP，加去RNA酶處理水定容至50 mL，放入棕色瓶避光保存.

1.3 實驗方法

1.3.1 預(yù)處理

實驗所用研缽、研杵、玻璃制品經(jīng)1 μg/mL 去RNA 酶處理水浸泡24 h 以上，之后包裹錫箔紙于180 ℃烘箱中高溫滅菌處理.槍頭、離心管等塑料制品經(jīng)1 μg/mL 去RNA 酶處理水浸泡24 h 以上，之后經(jīng)高溫高壓滅菌處理，烘干備用.

1.3.2 提取總RNA 操作步驟

試劑盒法與Trizol 法分別按照各自的說明書進行，實驗重復(fù)3 遍，提取的RNA 在-80 ℃下保存?zhèn)溆?

CTAB 法提取大蒜總RNA 操作步驟：于65 ℃水浴中預(yù)熱1 mL CTAB 提取液.稱取0.1 g 植物材料，剪碎置入預(yù)冷過的研缽，加液氮研磨至粉末狀.轉(zhuǎn)移樣品至有CTAB 提取液的離心管中，立即激烈渦旋30 s，短時放回65 ℃水浴中（約5 min）.加入等體積的氯仿-異戊醇并渦旋混合，10 000 r/min 離心20 min.將上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管中，加入8 mol/L LiCl，使LiCl 的終濃度為2 mol/L，4 ℃下沉淀過夜（不超過16 h）.加入1 mL 質(zhì)量分數(shù)為0.5%的SDS，充分溶解后，加入等體積的氯仿-異戊醇并渦旋混合，10 000 r/min 離心20 min.冰浴 10 min 后，10 000 r/min 離心 20 min.先用 400 μL體積分數(shù)為70%的乙醇清洗沉淀，再用400 μL 無水乙醇清洗沉淀，自然干燥10 min，加入35 μL 滅活的去RNA 酶處理水室溫溶解.提取的RNA 在-80 ℃下保存?zhèn)溆?

酸性異硫氰酸胍法[20]經(jīng)改進后提取大蒜總RNA操作步驟：稱取0.1 g 植物材料，剪碎置入預(yù)冷過的研缽，加液氮研磨至粉末狀，加入1 mL 的Solution D 和7.2 μL 巰基乙醇，與粉末研至澄清.（以下步驟在冰上操作）倒入 5 mL 離心管中，加入 100 μL 2 mol/L 的NaAC（pH 值為4.0）顛倒數(shù)次混勻置冰上.加入等體積的水飽和酚，渦旋混合器上震蕩混勻，加入200 μL 氯仿-異戊醇（體積比為 49 ∶1），用力震蕩混勻，冰浴 30 min，期間顛倒數(shù)次，以不出現(xiàn)分層為宜.10 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比為 49 ∶1），再抽提 1 次，10 000 r/min 4 ℃離心 20 min.取上清，加入等體積的異丙醇和1/10 體積的1 mol/L NaAc（pH 值為 5.2），-20 ℃ 沉淀 1 h 以上.10 000 r/min 4 ℃離心25 min，棄上清，75%乙醇清洗2 次以除去鹽類和其他雜質(zhì).離心棄上清，每次10 000 r/min 4 ℃離心 5 min.自然干燥 10 min，加入 35 μL 滅活的去RNA 酶處理水室溫溶解.提取的RNA 在-80 ℃下保存?zhèn)溆?

1.3.3 總RNA 質(zhì)量檢測方法

使用Nano Drop 1000 紫外分光光度計檢測RNA樣品的濃度及純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性.

1.3.4 RT-PCR 檢測

使用M-MLV Reverse Transcriptase Protocol 試劑盒（美國 Promega 公司）進行 RT-PCR，以 2 μg RNA 為模板進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 用于隨后的PCR 反應(yīng).采用唐巧玲[21]設(shè)計的引物進行PCR 擴增，引物GActinF的 序 列 為 5′-GAATCCAAAGGCAAATAGA GAG-3′，GActinR 的序列為 5′-CATCACCAGAATCCAGAACAAT-3′，擴增產(chǎn)物為 143 bp.反應(yīng)體系包括：cDNA 1 μL，上下游引物分別為 0.25 μL，Ex Taq 酶 0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，ddH2O 18.75 μL.反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃反應(yīng) 20 s，58 ℃反應(yīng)20 s，72 ℃反應(yīng) 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min.

1.3.5 基因表達譜測序

利用改進酸性異硫氰酸胍法提取的總RNA 樣品經(jīng)檢測合格后，進行文庫構(gòu)建.用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，隨后加入fragmentation buffer將mRNA 打斷成短片段.以mRNA 為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase I 和 RNase H 合成第二鏈cDNA，再用AMPure XP beads 純化雙鏈cDNA.純化的雙鏈cDNA 先進行末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads 進行片段大小選擇.最后進行PCR 擴增，并用AMPure XP beads 純化PCR 產(chǎn)物，得到最終的文庫.文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0熒光定量儀進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 生物分析儀對文庫的insert size 進行檢測，insert size 符合預(yù)期后，使用Q-PCR 方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2 nmol/L）以保證文庫質(zhì)量.庫檢合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進行Illumina HiSeq 測序.測序得到原始序列（sequenced reads 或者raw reads），里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads.為了保證信息分析質(zhì)量，必須對raw reads過濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads.數(shù)據(jù)處理步驟如下：

（1）去除帶接頭（adapter）的 reads；

（2）去除N（N 表示無法確定堿基信息）的比例大于 10%的 reads；

（3）去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Qphred ≥20 的堿基數(shù)占整個reads 50%以上的reads）.

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜花發(fā)育不同階段的解剖學(xué)觀察

對大蒜花芽分化的不同階段進行解剖學(xué)觀察，結(jié)果如圖1 所示.

圖1 不同發(fā)育時期的大蒜花器官解剖圖（標尺=1 mm）Fig.1 Anatomy of garlic floral organs at different developmental stages（bar=1 mm）

根據(jù)花芽長度不同，將花芽分化分為3 個時期：花芽長度≤0.5 cm 時記作B1 期，花芽長度為0.5～2.0 cm時記作B2 期，花芽長度≥2.0 cm 時記作B3 期.隨著大蒜花莖的伸長，在大蒜抽薹后，對花粉母細胞進行細胞學(xué)觀察，將花粉母細胞進入減數(shù)分裂期之前記作F1 期，處于減數(shù)分裂期記作F2 期，減數(shù)分裂期之后記作 F3 期.

2.2 不同方法提取大蒜鱗莖和花器官總RNA完整性的比較

圖2 為不同方法提取大蒜鱗莖總RNA 的電泳圖譜.由圖2 可以看出，5 種方法均能夠得到28S 和18S條帶.相較于普洛麥格試劑盒法、CTAB 法和Trizol法，使用天根試劑盒和改進酸性異硫氰酸胍法提取的總RNA 條帶明亮，且28S 條帶亮度約為18S條帶亮度的2 倍，說明RNA 無降解，且無蛋白質(zhì)及DNA 污染，質(zhì)量較好.改進酸性異硫氰酸胍法提取的總RNA中5S rRNA 亮度顯著高于其他方法，說明該方法所得RNA 的完整性更好.

圖2 不同方法提取大蒜鱗莖總RNA 的電泳檢測Fig.2 Electrophoresis of total RNA extracted from garlic bulbs by different methods

用篩選出的天根試劑盒法和改進酸性異硫氰酸胍法提取大蒜不同時期花器官的總RNA，電泳檢測結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，2 種方法提取的大蒜不同時期花器官的總RNA 都可以得到較為明亮的28S 和18S 條帶.同天根試劑盒法相比，用改進酸性異硫氰酸胍法提取的總RNA 中5S rRNA 的亮度更大，說明該方法提取的RNA 完整性更好，更適于提取大蒜花器官的總RNA.

圖3 不同方法提取大蒜花器官總RNA 的電泳檢測Fig.3 Electrophoresis of total RNA extracted from garlic floral organs by different methods

2.3 不同方法提取大蒜鱗莖和花器官總RNA純度和收率的比較

濃度和純度是判斷RNA 質(zhì)量優(yōu)劣的重要標準，OD260/OD280比值和OD260/OD230比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的參考指標.高質(zhì)量RNA 的 OD260/OD280值在1.8～2.1 之間，比值為2.0 的RNA 質(zhì)量最優(yōu)；OD260/OD230的比值通常在2.0 左右，比值大于2.0 說明RNA無蛋白、有機試劑或多糖多酚類雜質(zhì)的污染.檢測5種方法提取的大蒜鱗莖總RNA 的純度及濃度，結(jié)果如表1 所示.

表1 不同方法提取大蒜鱗莖和花器官總RNA 的濃度及純度Tab.1 Concentration and purity of total RNA extracted from garlic bulbs and floral organs by different methods

由表1 可以看出，5 種方法提取的大蒜鱗莖總RNA 的 OD260/OD280比值均在 1.8～2.1 之間，其中，使用天根試劑盒方法和改進酸性異硫氰酸胍法提取的總RNA 的 OD260/OD280更接近 2.0，且 OD260/OD230比值均大于2.0，說明RNA 質(zhì)量好，無蛋白、有機試劑或多糖多酚類雜質(zhì)污染.改進酸性異硫氰酸胍法提取的鱗莖RNA 濃度比天根試劑盒法提高了約3.5 倍.進一步將天根試劑盒方法和改進酸性異硫氰酸胍方法用于提取大蒜花器官不同發(fā)育時期的總RNA，以F1 期為例，改進酸性異硫氰酸胍法提取的花器官RNA 濃度比天根試劑盒法提高了近3 倍.由此可見，改進酸性異硫氰酸胍法提取RNA 的收率更高，且成本較試劑盒法低.

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果

為進一步檢測RNA 質(zhì)量，以提取的大蒜鱗莖和花器官總RNA 反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物cDNA 為模板，擴增Actin 部分片段，片段長度為143 bp，電泳結(jié)果如圖4所示.泳道1、2 為改進酸性異硫氰酸胍法的RT-PCR結(jié)果，同試劑盒法相比，前者能夠擴增出單一且清晰的目標條帶，未見非特異產(chǎn)物，說明提取的RNA 質(zhì)量好、純度高.

圖4 大蒜鱗莖和花器官的RT-PCR 電泳檢測Fig.4 RT-PCR electrophoresis of RNA extracted from garlic bulbs and floral organs respectively

2.5 RNA測序及庫檢結(jié)果

對改進酸性異硫氰酸胍法提取的大蒜花器官的RNA 進行測序和庫檢，部分檢測結(jié)果如圖5 所示（每個發(fā)育時期選取2 組生物學(xué)重復(fù)，圖為F1 時期的2組生物學(xué)重復(fù)檢測結(jié)果）.Adapter related 代表因有接頭過濾掉的reads 數(shù)及其占raw reads 數(shù)的比例；Containing N 代表因N 含量超過10%過濾掉的reads 數(shù)及其占raw reads 數(shù)的比例；Low quality 代表因低質(zhì)量過濾掉的reads 數(shù)及其占raw reads 數(shù)的比例；Clean reads代表最終得到的clean reads 數(shù)及其占raw reads 數(shù)的比例.

圖5 測序樣品的原始數(shù)據(jù)Fig.5 Raw data of sequenced samples

上述過濾掉的reads 數(shù)占raw reads 數(shù)的比例極低，得到的clean reads 均大于98%，表明使用改進酸性異硫氰酸胍法提取的總RNA 的質(zhì)量能夠滿足RNA-seq分析的要求.

3 討論與結(jié)論

為了獲得高質(zhì)量、高收率的大蒜花器官RNA 樣品，本研究先以多糖多酚類物質(zhì)含量高的大蒜鱗莖作為實驗材料，采用 2 種試劑盒方法、CTAB 法、Trizol 法以及改進酸性異硫氰酸胍法提取RNA，篩選出了RNA 提取質(zhì)量較優(yōu)的天根試劑盒法和質(zhì)量、收率均較優(yōu)的改進酸性異硫氰酸胍法.與傳統(tǒng)的異硫氰酸胍法相比，改良的提取方法中，在提取液solution D 中添加了2%的PVP，PVP 不僅可以去除組織中的多糖多酚類物質(zhì)，還能去除一些其他色素和脂類物質(zhì)，同時可以消除泡沫，保護膠體，得到更完整和純度更高的RNA 產(chǎn)物[22].在異丙醇沉淀時，加入1/10 體積的1 mol/L NaAc（pH 值為 5.2），NaAc 可以沉淀糖類，有效去除組織中的多糖.通過改進酸性異硫氰酸胍法去除了DNA和蛋白質(zhì)殘留，有效避免了多糖多酚物質(zhì)對RNA 質(zhì)量的干擾，同試劑盒法相比，提取的RNA 的純度、收率以及完整性更高.

轉(zhuǎn)錄組測序分析對RNA 的產(chǎn)率和質(zhì)量有較高的要求：植物樣本 RNA 質(zhì)量濃度≥400 ng/μL，OD260/OD280為 1.8～2.2，OD260/OD230＞ 2.0，28S/18S 之值 ＞ 1.0[8，18].本研究中，天根試劑盒法和改進酸性異硫氰酸胍法提取的大蒜花器官總RNA 的OD260/OD280均在2.0～2.1 之間，RNA 純度較高，改進酸性異硫氰酸胍法的OD260/OD280更接近2.0，純度較試劑盒法更高.試劑盒法提取的RNA 濃度小于400 ng/μL，即收率較少，而改進酸性異硫氰酸胍法提取的RNA 質(zhì)量濃度超過了800 ng/μL.確定改進酸性異硫氰酸胍法最優(yōu)體系后，將該方法應(yīng)用于提取大蒜花器官的總RNA，分離得到的RNA 質(zhì)量高、收率高且重復(fù)性好，測序得到的cleanreads 均大于98%，完全能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測序分析的要求.